Prisenti†Indirizzu attuali: OX11 0DE, Regnu Unitu, Edificiu Diamanti, Parcu dâ Scienza e dâ Nnovazzioni Harwell, Dietcote, Oxfordshire, Regnu Unitu, Co.
Lu cumplessu di raccolta dâ luci dû centru di riazziuni 1 (RC-LH1) è lu cumpunenti fotusinteticu cintrali dî batteri fotutrofici viola. Ntruducemu du' strutturi di micruscopia criu-elittrònica dû cumplessu RC-LH1 dû Rhodopseudomonas palustris. La struttura a risuluzziuni 2,65 Å dû cumplessu RC-LH114-W è furmata di 14 cicli di sutunità LH1 ca circonnunu lu RC, ca è ntirruttu dâ prutiina W, mentri lu cumplessu senza prutiina-W è cumplitamenti na cumpusizziuni RC circunnata di RC. Ciclu LH1 di 16 sutunità chiusi. Lu cunfrontu di sti strutturi duna nfurmazziuni supra li dinamichi dû chinuni ntà lu cumplessu RC-LH1, inclusi canciamenti cunfurmativi pricidentimenti inditirminati quannu si liga lu chinuni ntò situ RC QB, ortri ca la pusizziuni dî siti di ligami ausiliari dû chinuni, ca l'aiutunu a passari ô RC. La struttura unica dâ prutiina W evita la chiusura dû ciclu LH1, criannu accussì nu canali pi accilirari lu scanciu chinuni/chinuluni.
L'enirgìa furnita dâ fotusintisi po sustiniri quasi tutta la vita nnâ Terra, e havi nu putinziali granni pâ biutecnuluggìa sulari. Puru si prumovunu la fotusintisi glubbali, li batteri fotutrofici viola mustranu puru vari modi d'energia e capacità metabolichi. Ponnu evitari la fotusintisi e crisciri comu batteri eterotrofici ntò buiu, ponnu fissari l'azzotu e lu diossidu di carboniu, prudurri idrògginu e digradari li cumposti arumatici (1-3). Pî dari enirgìa a chisti prucessi, la luci havi a èssiri cummirtuta ‘n enirgìa chìmica ‘n manera lesta ed efficienti. Stu prucessu accumincia quannu lu cumplessu di l’antinna ca ntrappula la luci assorbi la luci e trasfirisci l’enirgìa ntrappulata ô centru di riazzioni (RC), accuminciannu accussì la siparazzioni dâ càrrica (4 – 7). L'unità di basi dâ fotusintisi nté batteri fotutrofici viola è cumposta di tipu 2 RC, circunnatu dû cumplessu di raccolta dâ luci 1 (LH1), furmannu lu cumplessu nucliari RC-LH1. LH1 è furmatu di na matrici d'etirodimeri αβ curbi, ognunu dî quali liga du' muleculi di clorufilla batteriana (BChl) e unu o du' carutinòidi (8-12). L'antenna LH1 cchiù simplici è fatta di 16 o 17 eterudimeri αβ ca circùnnunu lu RC (9-13) ntà nu ciclu chiusu, ma ntà autri cumplessi nucliari, li peptidi transmimbrani interrumpunu la cuntinuità dû LH1 circustanti, prumuvennu accussì la diffusioni dû chinolu/chinunu e lu cumpostu bRC1, 13-15). La chianta fotutròfica viola Rhodopseudomonas (Rps.) è n'urganìsimu mudeḍḍu ca po capiri l'enirgìa e lu trasfirimentu di elittruna ca susteni la fotusintisi. La prima struttura di cristallu di Rps. Lu mudellu dû cumplessu RC-LH1 dû palustri è RC, circunnatu di 15 cicli LH1 eterodimerici, ca sunnu ntirrutti di na prutiina scanusciuta chiamata "Pruteina W" (14). La prutiina-W fu poi idintificata comu RPA4402, ca è na prutiina non caratterizzata di 10,5 kDa cu tri elichi transmimbrani privisti (TMH) (16). Si prupunimu di canciari lu nomu dû geni rpa4402 ca cudifica la prutiina W pi pufW pi èssiri coerenti câ numinclatura usata pî geni ca cudificanu li sutunità RC-L, M (pufL, pufM) e LH1α, β (pufA, pufB). È ntirissanti ca la prutiina-W è prisenti sulu ntà circa lu 10% di RC-LH1, rivilannu Rps. palustris pruduci du cumplessi RC-LH1 diversi. Ccà, ripurtamu li strutturi criu-EM a àuta risuluzzioni (cryo-EM) di du' cumplessi nucliari, unu câ prutiina W e 14 eterodimeri αβ, l'autru senza prutiina W e nu ciclu chiusu di 16 eterodimeri LH1. La nostra struttura rapprisenta nu canciamentu a passaggiu ntâ cumprinsiuni dû cumplessu RC-LH1 di Rps. palustris, picchì analizzamu la populazziuni omuggènia di ogni varianti e avemu na risuluzziuni sufficienti pi assignari chiaramenti ogni peptidi e pigmenti ligati e lipidi e chinuni currilati. Lu cunfrontu di sti strutturi mustra ca li tri pruteini TMH-W ca non furu truvati ntà nuḋḋu autru cumplessu RC-LH1 nzinu a ora ginirunu nu canali chinuni pi accilirari lu scanciu chinuni/chinuluni. Furu identificati nu certu nummuru di siti di ligami lipidici e chinuni sarbati e rivilamu nu novu canciamentu cunfurmativu doppu la cumminazziuni di chinuni e RC, ca pò essiri adattu pò fotusistema II (PSII) RC di l'organismi fotutrofici ossigginati. Li nostri scuperti dannu novi ntuizziuni ntà cinètica dû ligami e dû scanciu chinoni/chinoni ntà lu cumplessu nucliari RC-LH1 dî batteri fotutrofici viola.
Pî facilitari nu studiu dittagghiatu dî du’ cumplessi attruvati nnî Rps. palustris, isulamu ogni RC-LH1 cu mètudi biuchimici. Lu cumplessu prutìicu ca nun havi W (di seguitu chiamatu ΔpufW) fu purificatu dû ceppu ca nun avìa lu geni pufW (16) e si poti prudùciri sulu nu cumplessu RC-LH1. Lu cumplessu ca cunteni la proteina W è pruduttu di nu ceppu. La proteina W di chistu ceppu veni canciata cu nu tag His 10 voti ntô termini C accussì lu cumplessu ca cunteni proteina W si poti ammiscari câ proteina W ca nun c’è cchiù immobbilizzannu lu mitaḍḍu. Lu cumplessu è siparatu effittivamenti (16) Crumatugrafìa d'affinità (IMAC).
Comu mustratu ntâ Figura 1, tutti dui li cumplessi cuntèninu tri suttaunità RC (RC-L, RC-M e RC-H) circunnati di n'antinna LH1. La struttura 2,80-A dû cumplessu senza prutiina-W mustra 16 eterodimeri αβ, furmannu nu ciclu LH1 chiusu ca circonna completamenti lu RC, di seguitu chiamatu cumplessu RC-LH116. La struttura di 2,65 Å dû cumplessu ca cunteni prutiina-W avi nu LH1 a 14 eterodimeri ntirruttu dâ prutiina-W, di seguitu chiamatu RC-LH114-W.
(A e B) Rapprisintazzioni supirficiali dû cumpostu. (C e D) Pigmenti ligati espressi ntà stiḍḍi. (E e F) Li cumplessi ossirvati dâ supirfici cituplasmatica hannu li peptidi e li sutunità LH1 rapprisintati nté cartuni animati e sunnu nummarati 'n sensu urariu dû divariu proteina-W [coerenti câ nummarazziuni Rba. cumplessu di sfiroidi (13)]. Pi LH1-α, lu culuri dâ sutunità pruteica è gialli; pi LH1-β, lu culuri dâ sutunità pruteica è blu; pâ prutiina-W, la prutiina è russa; pi RC-H, è cianu; pi RC-L, è Aranciuni; pi RC-M, magenta. Li cufatturi sunnu rapprisintati di stiḍḍi, lu virdi rapprisenta li muleculi di BChl e BPh a, lu viola rapprisenta li carutinòidi e lu gialli rapprisenta li muleculi UQ10. (G e H) Vista ngrannita dû divariu prutiina-W ntâ riggiuni equivalenti dû cumplessu RC-LH114-W (G) e dû cumplessu RC-LH116 (H). Li cufatturi su' mustrati sutta forma di riempimentu dû spazziu, la chinuna chilata è mustrata 'n blu. Lu divariu prutiina-W è suttaliniatu di na linia trattijata blu ntà (G) e li pirtusi nichi aunni la chinuna/chinololu si diffunni ntà l'aneḋḋu LH116 sunnu suttaliniati di na linia trattijata niura ntà (H).
La figura 1 (A e B) mustra lu RC circunnatu di matrici aperti o chiusi d'eterodimeri LH1αβ, ognunu dî quali liga du BChl e nu carutinòidi (Figura 1, C e D). Studi pricidenti mustraru ca Rps è lu cumplessu LH1. Ntà via biusintetica dâ xantina dâ spirulina, sti speci cuntenunu populazziuni misti di carutinòidi (17). Com'è gghiè, la spirupirruxantina è lu carutinòidi duminanti e la sò dinsità è suddisfacenti. Pirciò, scigghiemu di mudeḍḍari la spiroxantina ntà tutti li siti di ligami LH1. Li polipeptidi alfa e beta sunnu singuli TMH cu riggiuni esterni di mimbrana curta (Figura 1, A, B, E e F). Puru si la dinsità di 17 residui ntò termini C non fu ossirvata, lu polipeptidi alfa fu scissu di Met1 a Ala46 ntà tutti dui li cumplessi. Lu polipèptidi β fu arridduttu di Gly4 a Tyr52 ntà RC-LH116 e di Ser5 a Tyr52 ntà RC-LH114-W. Non fu ossirvata na dinsità di 3 o 4 residui N-tirminali o 13 C-tirminali (Figura S1). L'analisi dâ spettrumetria di massa dû cumplessu mistu RC-LH1 priparatu dû ceppu di tipu sarvaggiu mustrò ca la riggiuni mancanti era lu risultatu dâ scissiuni eteròluga di sti peptidi (Figura S1 e S2). Fu ossirvata puru la furmilazziuni N-tirminali di α-Met1 (f). L'analisi mustrò ca lu α-peptidi è furmatu di residui fMet1 nzinu a Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 e lu β-peptidi è furmatu di residui Ser2 nzinu a Ala53, ca è d'accordu câ mappa di dinsità EM a vascia timpiratura.
La cuurdinazziuni di α-His29 e β-His36 renni li BChl facci a facci; ogni eterodimeri αβ s'assembla cchî sò vicini pi furmari nu ciclu apertu (RC-LH114-W) o nu ciclu chiusu (RC-LH116) ntunnu ô RC La matrici di pigmenti accuppiati di l'escituni (Figura 1, C e D). 'N paraguni câ banna di 877 nm di RC-LH114-W, lu spustamentu russu d'assuppamentu di 880 nm di RC-LH116 è di 3 nm (Figura 2A). Com'è gghiè, lu spettru dû dicruismu circulari è quasi lu stissu (Figura 2B), ca innica ca puru si c'è na diffirenza chiara ntra cicli aperti e chiusi, l'ambienti lucali dî BChl è assà simili. Lu spustamentu russu d'assorbimentu pò essiri lu risultatu di nu muvimentu termicu riduttu e na stabbilità aumintata ntà lu ciclu chiusu (18, 19), lu canciamentu ntà l'accoppiamentu dû pigmentu causatu dû ciclu chiusu (20, 21), o na cumminazziuni di sti du effetti (11).
(A) Spettru d’assuppamentu ultraviulettu/visibbili/quasi nfrarussu, li cui vetti sunnu signati cchî pigmenti currispunnenti e nurmalizzati ô piccu BPh a 775 nm. (B) Spettru di dicruìsimu circulari nurmalizzatu a l'assorbimentu di BChl a 805 nm. (C e D) Spettri ΔA silizziunati dî spettri d’assuppamentu arrisurbuti nnô tempu dû cumplessu RC-LH114-W (C) e dû cumplessu RC-LH116 (D). Pi na megghiu cumparabbilità, tutti li spettri su’ nurmalizzati a ∆A di -A a 0,2 ps. (E) La prubabbilità di ossidazzioni dû citucrumu c2 doppu l'irradiazziuni 'n prisenza di vari cuncintrazziuni di UQ2 (vidi Figura S8 pî dati grezzi). (F) Ntà li celluli crisciuti sutta luci a vascia, media o auta ntinsità (10, 30 o 300μMm-2 s-1, rispittivamenti), li sutunità pruteini W e RC-L ntò cumplessu purificatu e lu rapportu dâ mimbrana siparata. Additirminari lu liveḍḍu prutìicu cu l'elettruforesi a gel di poliacrilamida SDS e l'immunuassaggiu (vidi Figura S9 pî dati grezzi). Additirminari lu rapportu rispettu ô cumplessu RC-LH114-W purificatu. Lu rapportu stichiumètricu di RC-L e prutiina-W dû cumplessu è 1:1.
Li BChl ntà pusizziuni 1 ntò ciclu αβ14 difurmatu di RC-LH114-W (Figura 1, A, C e E) sunnu cchiù vicini ô dunaturi primariu RC (P) di 6,8 Å rispettu ê BChl equivalenti ntà RC-LH116 (Figura 1, B, S3); comunqui, la cinètica d'assuppamentu transienti dî du cumplessi mustra ca pi RC-LH114-W e RC-LH116, li custanti di tempu di trasfirimentu d'enirgìa d'eccitazziuni di LH1 a RC sunnu 40 ±4 e 44±3 ps (Figura 2). , C e D, Figura S4 e Tabbula S2). Nun ci sunnu macari diffirenzi significativi nnô trasfirimentu elettrònicu dintra RC (Figura S5 e testu supplimentari currilatu). Suspettamu ca la currispunnenza stritta dû tempu di trasfirimentu d'enirgìa ntra LH1 e RC-P è duvuta â distanza, angulu e enirgìa putinziali simili dâ maggiuranza di BChl ntê du' cicli di LH1. Pari ca esplurari lu schema enirgèticu LH1 p'agghigari â distanza mìnima nun è cchiù veloci dû trasfirimentu direttu d'enirgìa di siti sutta-ottimali a RC. Lu ciclu LH1 a ciclu apertu ntà RC-LH114-W po puru subbiri nu muvimentu termicu nsignificanti sutta cunnizziuni di timpiraturi vasci pi l'analisi strutturali, e c'è na cunfurmazzioni d'aneḍḍu αβ14 cchiù longa a timpiratura ambienti dâ distanza di pigmintazzioni di βBChls ntà pusizziuni di RC 1.
Lu cumplessu RC-LH116 cunteni 32 BChl e 16 carutinòidi e la sò disposizziuni cumplissiva è la stissa di chiḋḋa uttinuta dû pidpidum di Termocrumatiu (Tch.) (12) e alghi virdi (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Doppu l'allineamentu, furu ossirvati sulu diviazzioni nichi ntà pusizziuni di l'eterodimeri αβ, supratuttu 1-5, 15 e 16 (Figura S6). La prisenza dâ prutiina-W avi n'impattu mpurtanti ntà struttura di LH1. Li sò tri TMH sunnu culligati di cicli curti, cû tirminali N ntò latu dû lumen dû cumplessu e lu tirminali C ntò latu cituplasmaticu (Figuri 1A e 3, A nzinu a D). La prutiina-W è assà idrofubba (Figura 3B) e TMH2 e TMH3 intiraggìsciunu cu LH1αβ-14 pi furmari na supirfici transmimbrana (Figura 3, B e E nzinu a G). L'interfacci è cumposta principarmenti di residui Phe, Leu e Val ntà riggiuni transmimbrana. Sti residui sunnu ammucciati cu amminuacidi idrofubbi e pigmenti αβ-14. Quarchi residuu pulari cuntribbuisci puru â ntirazziuni, inclusu lu ligami d'idrògginu tra W-Thr68 e β-Trp42 ntà supirfici dâ cavità cumplessa (Figura 3, F e G). Ntà supirfici dû cituplasma, lu Gln34 è vicinu ô gruppu chitu dî carutinòidi αβ-14. Sparti, la mulecula di n-dudicil β-d-maltosidu (β-DDM) fu risolta e la sò cuda idrofubba s'allungau nzinu all'interfacci tra la pruteina-W e αβ-14 e la cuda lipidica si pò truvari ntò corpu. Nutamu puru ca li riggiuni di risuluzziuni C-tirminali dî prutiini W e RCH sunnu assà vicini, ma non ntà l'ambitu di furmari ntirazziuni spicifici (Figura 1, A e E). Com'è gghiè, ci ponnu essiri ntirazziuni ntà l'amminuacidi C-tirminali non risolti di sti du proteini, ca ponnu furniri nu meccanismu pi l'assunziuni dâ proteina-W duranti l'assimblaggiu dû cumplessu RC-LH114-W.
(A) La prutiina-W, ca s'affaccia ncapu l'interfacci cu LH1αβ14 'n furma di cartuni animati, àvi na catina latirali a furma di stiḍḍa (russa), mustrata nna na parti dû schema dû putinziali elettrustàticu (supirfici grigia trasparenti cu n'isulini di 0,13). (B) La prutiina-W rapprisintata di na supirfici culurata idròfubba. L'arii pulari e caricati sunnu mustrati 'n cianu, l'arii idròfubbi sunnu mustrati 'n jancu e l'arii fortimenti idròfubbi sunnu mustrati 'n aranciuni. (C e D) La prutiina-W rapprisintata ntô cartuni animatu, lu so urientamentu è lu stissu di chiḍḍu di (A) (C) e rutatu di 180° (D). Sicunnu la pusizziuni ntà siquenza, li residui distinti aduttunu nu schema di culura archinuè, unni lu tirminali N è blu e lu tirminali C è russu. (E) La prutiina-W ntà stissa vista di (A), e li residui ntà l'interfacci dâ prutiina-W:LH1 sunnu rapprisintati di stiḍḍi cu signa attaccati. (F) La prutiina-W è rutata di 90° rispettu a (E) e LH1αβ14 nnâ rapprisintanza dû cartuni animatu, e rispettu ê residui di ntirfacci nnâ rapprisintanza dâ barra. Li residui ca s'affaccianu dû polipeptidi beta sunnu marcati. Lu cufatturi è mustratu comu na barra ca currispunni ô culuri dâ Figura 1, lu β-DDM dicumpustu è mustratu ‘n griciu e l’ossìgginu è mustratu ‘n russu. (G) La vista nna (F) è rutata di 180°, cu li residui pruminenti dû polipèptidi alfa marcatu.
La prutiina-W scancia n'eterodimeri αβ (lu quinnicèsimu ntà Figura 1F), evitannu accussì la chiusura dû ciclu e inclinannu li primi tri eterodimeri αβ. Si vitti ca l’àngulu di nclinazzioni massimu dû primu eterudimeri αβ-1 rispettu â pillìcula nurmali era di 25° a 29° (Figura 1, A e E), ca fu furmatu di l’inclinazzioni di 2° a 8° di αβ-1 nnâ RC A cuntrastu forti-LH116 e F (Figura 1, B). Lu sicunnu e lu terzu eterudimeri su' nclinati rispittivamenti di 12° a 22° e di 5° a 10°. A causa di l'intrappu stericu di RC, l'inclinazziuni di αβ-1 non includi la sicunna coppia di αβ (ca currispunni ô 16° αβ ntà Figura 1F), furmannu accussì nu divariu chiaru ntà l'aneḋḋu LH1 (Figura 1, A e E). A causa dâ mancanza di du eterodimeri αβ, accumpagnata dâ pèrdita di quattru BChl e du carutinòidi, nuḋḋu dî carutinòidi si liga â sutunità αβ-1 storta, purtannu a n'aneḋḋu LH114-W ca cunteni 13 carutinòidi viggitariani e 28 BChl. Li stimi di risuluzziuni lucali dî du cumplessi ntà li riggiuni αβ1 nzinu a 7 sunnu cchiù vasci di chiḋḋi dû restu dû ciclu LH1, ca pò riflèttiri la plasticità inerenti dâ sutunità LH1 vicinu ô situ RC QB (Figura 4).
Li mmàggini di RC-LH114-W (A e B) e RC-LH116 (C e D) su’ mustrati dâ stissa vista supiriuri/latirali (A e B) (A e C) e dâ supirfici dâ cavità dâ Fig. 1. (B e D). Li tasti culurati su' mustrati a manu dritta.
L'unicu autru cumplessu nucliari carattiristicu cu na prupurzioni stichiumetrica di 1:14 è lu dimeri RC-LH1-PufX dû rodococcu sferoidi (Rba.) (13). Com'è gghiè, li proteini W e PufX nun hannu n'omoluggìa chiara e hannu n'impattu mpurtanti nté sò strutturi LH1 rispittivi. PufX è nu singulu TMH cu nu duminiu cituplasmaticu N-tirminali ca intiraggisci cû latu cituplasmaticu dâ sutunità RC-H (13) ntà na pusizziuni currispunnenti a Rps. lustru LH116αβ-16. PufX cria nu canali pò scanciu chinuni/chinuluni tra RC-LH1 e lu cumplessu citucrumu bcl ed è prisenti ntà tutti l'Rba. cumplessu dû nùcliu dî sfiroidi (13). Puru si la ntirfacci munòmiru-munòmiru è nna Rba. Lu dimeri sfiroidi RC-LH1-PufX s'attrova ntà pusizziuni di ligami dâ prutiina W ntà RC-LH114-W e lu divariu induttu di PufX e prutiina-W s'attrova ntà na pusizziuni equivalenti (Figura S7A). Lu divariu ntà RC-LH114-W è puru alliniatu cû canali chinunu iputeticu (8) dû Pseudomonas rosea LH1, ca è furmatu di peptidi non currilati â prutiina W o PufX (Figura S7B). Sparti, lu canali chinunu ntà Blc. Lu LH1 virdi smaraldu furmatu escludennu na sutunità γ (7) s'attrova ntà na pusizziuni simili (Figura S7C). Puru si è mediatu di pruteini diversi, la cumparsa di sti canali chinuni/chinololi ntà na posizziuni cumuni ntà lu cumplessu RC-LH1 pari essiri n'esempiu d'evuluzziuni cummirgenti, ca innica ca lu divariu criatu dâ pruteina W pò agiri comu nu canali chinuni.
Lu divariu ntò ciclu LH114-W pirmetti la furmazziuni di na riggiuni di mimbrana cuntinua tra lu spazziu nternu dû cumplessu RC-LH114-W e la mimbrana dû massa (Figura 1G), chiuttostu ca culligari li du dumini attraversu nu poru pruteicu comu nté pruteini. Lu cumplessu RC-LH116 è simili a nu Tch chiusu. Cumplessu a furma di agugghia (22) (Figura 1H). Siccomu la diffusiuni dû chinonu attraversu la mimbrana è cchiù veloci dâ diffusioni attraversu lu canali pruteicu strittu, lu ciclu LH114-W apertu pò cunsentiri nu turnu RC cchiù veloci rispettu ô ciclu LH116 chiusu e la diffusioni dû chinonu ntà RC pò essiri cchiù ristritta. Pi pruvari si la prutiina W nfruenza la cunvirsiuni dî chinuni attraversu RC, ficimu n'assaggiu di ossidazzioni dû citucromu ncapu na certa cuncintrazziuni di ubichinuna 2 (UQ2) (n'analugu di UQ10 naturali cu na cuda di isuprenu cchiù curta) (Figura 2E). Puru si la prisenza dû chinu chilatu frena la ditirminazziuni accurata dâ custanti apparenti di Michaelis (RC-LH114-W e RC-LH116 sunnu adatti pi 0,2±0,1μM e 0,5±0,2μM, rispittivamenti), lu tassu massimu di RC-LH1±4-6W-1. 28±5% cchiù granni di RC-LH116 (3,6±0,1 e-RC-1 s-1).
Accuminciannu stimamu ca la prutiina-W è prisenti ntà circa lu 10% dû cumplessu nucliari (16); ccà, li tassi d'occupazziuni dî celluli di criscita a vascia luci, media luci e auta luci sunnu rispittivamenti 15±0,6%, 11±1% e 0,9±0,5 % (Figura 2F). Lu cunfrontu quantitativu dâ spettrumetria di massa mustrò ca l'agghiunta dû tag di istidina nun arridduciu l'abbunnanza rilativa di prutiini-W rispettu ê ceppi di tipu sarvaggiu (P = 0,59), quinni sti liveḍḍi nun sunnu n'artifattuu di prutiini-W modificati (Figura S10). Com'è gghiè, chista vascia occupazziuni dâ proteina-W ntò cumplessu RC-LH1 pò cunsentiri a quarchi RC di canciari a na velocità accilirata, mitigannu accussì lu scanciu cchiù lentu di chinuni/chinuluni ntò cumplessu RC-LH116. Nutamu ca l'autu tassu d'occupazziuni dâ luci è incoerenti cchî dati trascrittòmici ricenti, ca innica ca l'esprissiuni ginètica pufW aumenta sutta luci forti (Figura S11) (23). La diffirenza tra la trascrizziuni pufW e l'incorpurazziuni dâ proteina-W ntò cumplessu RC-LH1 è cunfusa e putissi riflèttiri la rigulazziuni cumplessa dâ proteina.
Ntà RC-LH114-W, 6 cardiulipini (CDL), 7 fosfatidilcolina (POPC), 1 fosfatidilglicerolu (POPG) e 29 muleculi di β-DDM sunnu stanziati e mudellati ntà 6 CDL, 24 POPC, 2 POβDM e 12. RC-LH116 (Figura 5, A e B). Ntà sti du strutturi, lu CDL s'attrova quasi ntò latu cituplasmaticu dû cumplessu, mentri lu POPC, lu POPG e lu β-DDM si trovunu principarmenti ntò latu luminali. Du muleculi di lipidi e ditirggenti furu isulati ntà riggiuni αβ-1 nzinu a αβ-6 dû cumplessu RC-LH114-W (Figura 5A) e cincu furu isulati ntà riggiuni equivalenti di RC-LH116 (Figura 5B). Furu truvati cchiù lipidi ntà l'autru latu dû cumplessu, principarmenti CDL, accumulati tra RC e αβ-7 nzinu a αβ-13 (Figura 5, A e B). Autri lipidi e ditirggenti risolti strutturalmenti si trovunu fora di l'aneḋḋu LH1 e li catini acili risolti s'allunganu tra sutunità LH1, provvisoriamenti disignati comu β-DDM ntà RC-LH114-W e difiniti comu β-DDM ntà RC A misculanza di βPOPC-DHDM e 166. Li posizziuni simili dî lipidi chilanti e li ditirggenti ntà nostra struttura innicanu ca sunnu siti di ligami fisiuloggicamenti rilivanti (Figura S12A). Li pusizzioni di muleculi equivalenti nna Tch ànnu puru na bona cunzistenza. Gentili e Trv. Lu ceppu 970 RC-LH1 (Figura S12, B nzinu a E) (9, 12) e li residui di ligami a l'idrògginu dû gruppu di testa lipidica mustraru na cunsirvazziuni abbastanza bona ntà l'allineamentu dâ siquenza (Figura S13), ca innica ca lu CDL sarbatu ca si liga a RC (24), sti siti ponnu essiri cunsirvati ntà RC (24).
(A e B) Li peptidi RC-LH114-W (A) e RC-LH116 (B) sunnu rapprisintati dî cartuni animati e li pigmenti sunnu rapprisintati dî stiḍḍi, usannu lu schema di culura ntà Figura 1. Li lipidi sunnu mustrati cu russu e li ditirggenti sunnu mustrati cu grigiu. L'UQ ligatu ê siti RC QA e QB è giallu, mentri l'UQ isulatu è blu. (C e D) Li stissi punti di vista di (A) e (B), cu lipidi omissi. (E a G) Vista ngrannuta di Q1(E), Q2(F) e Q3(G) di RC-LH116, cu catini latirali ca nfruènzanu l'una cu l'autra. Li ligami d'idrògginu sunnu mustrati comu lini trattijati niuri.
Ntà RC-LH116, sia RC QA ca QB UQ, ca partècipunu ô trasfirimentu d'elittruna ntò prucessu di siparazziuni dâ carica, si dicompònunu ntà li so siti di ligami. Cumunca, nnô RC-LH114-W, lu chinunu QB nun fu arrisurbutu e veni discussu ntô dittagghiu sutta. Ortri ê chinuni QA e QB, du muleculi UQ chilati (ca si trovanu ntra l'aneḋḋi RC e LH1) sunnu ôcazziunati ntà struttura RC-LH114-W sicunnu li sò gruppi di testa ben risolti (ca si trovanu rispittivamenti ntà Q1 e Q2). spazziu). Figura 5C). Du’ unità di isuprinu su’ assignati a Q1, e la mappa di dinsità arrisolvi li 10 cudi di isuprinu cumpleti di Q2. Ntà struttura di RC-LH116, tri muleculi UQ10 chilati (Q1 a Q3, Figura 5D) furu arrisurbuti e tutti li muleculi hannu na dinsità chiara ntà tutta la cuda (Figura 5, D a G). Ntê du strutturi, li pusizziuni dî gruppi di testa chinuna di Q1 e Q2 hannu na cunsistenza eccillenti (Figura S12F) e ntiraggìsciunu sulu cu RC. Q1 s'attrova all'ingressu dû spazziu W di RC-LH114-W (Figura 1G e 5, C, D e E), e Q2 s'attrova vicinu ô situ di ligami QB (Figura 5, C, D) e F). Li residui L-Trp143 e L-Trp269 sarbati sunnu assà vicini a Q1 e Q2 e dannu ntirazziuni π-stacking putinziali (Figura 5, E e F e Figura S12). L-Gln88, 3,0 Å di l'ossìgginu distali di Q1, duna nu ligami d'idrògginu forti (Figura 5E); chistu residuu è sarbatu ntà tutti li RC tranni ca ntà rilazziuni cchiù luntana (Figura S13). L-Ser91 è sustituitu cunservativamenti cu Thr ntà maggiuranza di l'autri RC (Figura S13), è 3,8 Angstrom di l'ossìgginu mitilicu di Q1 e pò furniri ligami d'idrògginu debbuli (Figura 5E). Q3 non pari aviri n'intirazziuni spicifica, ma s'attrova ntà riggiuni idrofubba tra la sutunità RC-M e la sutunità LH1-α 5 nzinu a 6 (Figura 5, D e G). Q1, Q2 e Q3 o chinuni chilati vicini foru arrisurbuti puru nne Tch. Gentili, Trv. Ceppu 970 e Blc. La struttura di l'iridi (9, 10, 12) punta a nu situ di ligami ausiliari sarbatu dû chinuni ntà lu cumplessu RC-LH1 (Figura S12G). Li cincu UQ dicumpusti nna RC-LH116 su' d'accordu cû 5,8±0,7 di ogni UQ ditirminatu dâ cromatugrafìa liquida a granni rinnimentu (HPLC), mentri li tri UQ dicumpusti nna RC-LH114-W su' cchiù vasci di chiḍḍu ca lu valuri misuratu di 6,2±0,3 nun su' (Figg. struttura.
Li polipeptidi L e M pseudo-simmetrici cuntenunu ciascunu cincu TMH e formunu n'eterodimeri ca cummina nu dimeri BChl, du munumeri BChl, du munumeri batteriofagi (BPh) e nu ferru non-Eme e una o du muleculi UQ10. Attraversu la prisenza dî ligami d'idrògginu ntà lu gruppu chitunicu tirminali e lu sò accumulu canusciutu ntà Rps, li carutinòidi sunnu incorpurati ntà suttanità M, chiamata cis-3,4-diidroorrudopina. Speci (25). Lu duminiu dâ mimbrana esterna di RC-H è ancoratu â mimbrana di nu singulu TMH. La struttura cumplissiva dû RC è simili ê tri sutunità RC dî speci currilati (comu Rba). sfiroidi (ID PDB: 3I4D). Li macrucicli di BChl e BPh, la spina dursali carutinòidi e lu ferru non eme si suvrapponnu ntà l'intervallu di risuluzziuni di sti strutturi, accussì comu lu gruppu di testa UQ10 ntò situ QA e lu chinuni QB ntà RC-LH116 (Figura S15).
La dispunibbilità di du strutturi RC cu tassi d'occupazziuni dû situ QB diversi duna na nova opportunità pi esaminari li canciamenti cunfurmativi coerenti ca accumpagnunu lu ligami dû chinonu QB. Ntò cumplessu RC-LH116, lu chinuni QB s'attrova ntà pusizziuni "prussimali" cumpletamenti ligata (26), ma la siparazziuni di RC-LH114-W non avi lu chinuni QB. Nun c'è nuḍḍu chinunu QB ntà RC-LH114-W, ca è surprinnenti picchì lu cumplessu è attivu, cchiù assai dû cumplessu RC-LH116 cu nu chinunu QB arrisurbutu strutturalmenti. Puru si li du' aneḋḋi LH1 chilanu circa sei chinuni, cincu su' strutturalmenti risolti ntà l'aneḋḋu RC-LH116 chiusu, mentri sulu tri su' strutturalmenti limitati ntà l'aneḋḋu RC-LH114-W apertu. Chistu disturbu strutturali aumintatu pò riflèttiri la sostituzziuni cchiù veloci dî siti QB RC-LH114-W, na cinètica cchiù veloci dî chinoni ntò cumplessu e n'aumentu dâ prubbabbilità d'attravirsari lu ciclu LH1. Suggirìmu ca la mancanza di UQ ntô situ RC QB di RC-LH114-W pò èssiri lu risultatu di nu cumplessu cchiù cumplessu e attivu, e lu situ QB di RC-LH114-W fu subbitu cugghiatu ntô fatturatu di UQ Lu stadiu spicìficu (l'ingressu ntô situ QB fu chiusu di chista cunfurmazzioni) rif.
Senza QB, la rutazziuni accumpagnanti di L-Phe217 ntà na pusizziuni ca è incumpatibbili cû ligami UQ10, picchì pruvucarà na cullisiuni spazziali câ prima unità di isuprenu dâ cuda (Figura 6A). Sparti, li canciamenti cunfurmazziunali principali chiari sunnu chiari, spicialmenti l'elica de (elica curta ntò ciclu tra TMH D e E) aunni L-Phe217 è spustatu ntà tasca di ligami QB e la rutazziuni di L-Tyr223 (Figura 6A) Pi rumpiri lu ligami d'idrògginu câ struttura di ligami Q5 e lu quatru di ligami Q5. situ (Figura 6B). L'elica di pivoti ntà so basi, lu Cα di L-Ser209 è spustatu di 0,33 Å, mentri lu L-Val221Cα è spustatu di 3,52 Å. Non ci sunnu canciamenti ossirvabbili ntà TMH D e E, ca sunnu suvrapponibbili ntà tutti dui li strutturi (Figura 6A). Pi quantu sapemu, chista è la prima struttura ntô RC naturali ca chiudi lu situ QB. Nu cunfrontu câ struttura cumpleta (ligata a QB) mustra ca prima ca lu chinuni veni riduttu, è nicissariu nu canciamentu cunfurmativu pi farilu trasiri ntò chinuni. L-Phe217 gira pi furmari na ntirazziuni π-stacking cû gruppu di testa chinuna e l'elica si sposta versu l'esternu, pirmittennu ô scheletru di L-Gly222 e â catina latirali di L-Tyr223 di furmari na riti di ligami d'idrògginu cu na struttura di ligami d'idrògginu stàbbili (Figura 6, A e C).
(A) Cartuni animati suvrapposti di olugramma (catina L, catina aranciuni/M, magenta) e struttura apo (grigiu), unni li residui chiavi su' mustrati sutta forma di na rapprisintazzioni a stiḍḍa. UQ10 è rapprisintatu di na barra gialla. La linia punteggiata innica li ligami d'idrògginu furmati ntà l'intera struttura. (B e C) La rapprisintanza supirficiali di l'apulipupruteina e l'intera struttura di l'aneḋḋu, suttaliniannu l'ossìgginu dâ catina latirali di L-Phe217 ntà blu e L-Tyr223 ntà russu, rispittivamenti. La sutunità L è aranciuni; li suttanità M e H nun sunnu culurati. (D e E) Siti RC QB di l'apulipupruteina (D) e interi (E) [culuri rispittivamenti di (A)] e lu tirmòfilu termòfilu PSII (virdi, blu cu chinuna plàstica; ID PDB: 3WU2) Alliniati (58).
Inaspittatamenti, puru si sunnu dispunibbili diversi strutturi di RC cu dificienza di QB senza LH1, li canciamenti cunfurmativi ossirvati ntà stu studiu non furu ripurtati prima. Chisti nchiùjinu la struttura di esaurimentu QB di Blc. viridi (ID PDB: 3PRC) (27), Tch. tèpidu (ID PDB: 1OCCHI) (28) e Rba. sfiroidi (ID PDB: 1OGV) (29), ca su' tutti quasi li stissi dâ so struttura QB cumplissiva. N'ispezziuni attenta dû 3PRC rivilàu ca li muleculi ditirggenti LDAO (ossidu di lauril dimetil amina) si liganu a l'ingressu dâ pusizzioni QB, ca po evitari lu riarrangiamentu nna na cunfurmazzioni chiusa. Puru si lu LDAO nun si scumponi ntâ stissa pusizzioni nna 1EYS o 1OGV, sti RC su' priparati usannu lu stissu ditirggenti e quinni ponnu prudùciri lu stissu effettu. La struttura di cristallu di Rba. Li sferoidi RC cu-cristallizzati cû citucrumu c2 (ID PDB: 1L9B) pari puru aviri nu situ QB chiusu. Com'è gghiè, ntà stu casu, la riggiuni N-tirminali dû polipeptidi RC-M (ca ntiraggisci cû situ di ligami QB attraversu lu ligami H dû residu Tyr ntà l'elica Q) adotta na cunfurmazziuni innaturali e lu canciamentu cunfurmativu QB non è ultiriurmenti espluratu (30). Ciò ca è rassicuranti è ca nun vittimu stu tipu di difurmazzioni dû polipeptidi M nnâ struttura RC-LH114-W, ca è quasi la stissa dâ riggiuni N-tirminali di RC-LH116 RC. Si avissi puru a nutari ca doppu l'eradicazzioni di l'antinna LH1 basata ncapu lu ditirggenti, li RC apolipupruteinici ntà PDB foru risolti, ca eliminaru li piscini di chinuni nterni e li lipidi ntà lu divariu ntra lu RC e la supirfici nterna di l'aneḍḍu LH1 circustanti (31, 32). Lu RC arresta funziunali picchì manteni tutti li cufatturi, tranni lu chinunu QB dicumpunìbbili, ca è cchiù picca stàbbili e spissu si perdi duranti lu prucessu di priparazziuni (33). Sparti, si sapi câ rimozziuni di LH1 e lipidi ciclici naturali dâ RC pò aviri n'impattu nté funziuni, comu la durata di vita accurzata dû statu P+QB siparatu dâ carica (31, 34, 35). Pirciò, spiculamu ca l'esistenza di l'aneḍḍu LH1 lucali ca circonna lu RC pò mantèniri lu situ QB "chiusu", prisirvannu accussì l'ambienti lucali vicinu lu QB.
Puru si l'apolipopruteina (senza chinuna QB) e la struttura cumpleta rapprisentunu sulu du istantanei dû fatturatu dû situ QB, chiuttostu ca na seri d'eventi, ci sunnu innicazziuni ca lu ligami pò essiri chiusu pi evitari lu riligami di l'idrochinuna pi inibbiri l'inibbizziuni dû sustratu. La ntirazziuni dû chinololu e dû chinonu vicinu lu situ QB di l'apolipopruteina pò essiri diversa, ca porta ô sò rifiutu di parti di RC. Si pinzau pi tantu tempu ca li canciamenti cunfurmativi hannu nu rolu ntò ligami e la riduzziuni dî chinuni. L'abbilità dî RC cugghiuti di ridduciri li chinuni doppu l'adattamentu scuru è ridutta (36); La cristallugrafia a raggi X mustra ca stu dannu è duvutu ê chinuni QB ca sunnu 'ntrappulati nna na cunfurmazzioni "distali" circa 4,5 Å dâ pusizzioni prossimali attiva (26) , 37). Suggirimu ca sta cunfurmazziuni di ligami distali è n'istantanea dû statu intermediu tra l'apolipopruteina e la struttura di l'aneḋḋu cumpletu, ca segui l'intirazziuni inizziali cû chinuna e l'apirtura dû situ QB.
Lu tipu II RC ca s'attrova ntò cumplessu PSII di certi batteri fotutrofici e cianubatteri, alghi e pianti avi na cunsirvazziuni strutturali e funziunali (38). L'allineamentu strutturali mustratu ntà Figura 6 (D e E) enfatizza la sumigghianza tra li RC PSII e lu situ QB dû cumplessu RC battericu. Stu cunfrontu fu pi tantu tempu nu mudellu pi studiari li sistemi strittamenti currilati di ligami e riduzziuni dî chinuni. Pubblicazziuni pricidenti suggiriru ca li canciamenti cunfurmativi sunnu accumpagnati dâ riduzziuni PSII dî chinuni (39, 40). Pirciò, cunzidirannu la cunsirvazzioni evulutiva di RC, stu miccanismu di ligami nun ossirvatu prima po èssiri applicabbili puru ô situ QB di PSII RC nne chianti fotutròfichi ossigginati.
Ceppi Rps ΔpufW (cancillazziuni pufW non marcata) e PufW-His (prutiina-W marcata cu His 10x espressa dû locus pufW naturali). palustris CGA009 fu discrittu nnô nostru travagghiu pricidenti (16). Sti ceppi e lu ginituri di tipu sarvaggiu isugènicu foru ricupirati dû cungelaturi strisciannu nu nùmmaru nicu di cèlluli ncapu PYE (ogni 5 g litri -1) (sarbati nta LB a -80 °C, cuntinenti 50% (p/v) di prutiina di glicirolu), estrattu di lievitu e succinatu (% agar/w) [15]. Lu placcu fu ncubatu duranti la notti ô scuru a timpiratura ambienti 'n cunnizzioni anaeròbbichi, e poi illuminatu cu luci janca (~50 μmolm-2 s-1) furniti di lampadini alòggini OSRAM 116-W (RS Components, UK) pi 3-5 jorna nzinu a quannu nun cumparìu na sula culonia. Na sula culonia fu usata pi inoculari 10 ml di menzu M22+ (41) ntigratu cu 0,1% (p/v) di àciti casamino (di seguitu chiamati M22). La curtura fu crisciuta sutta cunnizzioni di ossìgginu vasciu ô scuru a 34°C cu scuppiari a 180 rpm pi 48 uri, e poi 70 ml di curtura foru inoculati sutta li stissi cunnizzioni pi 24 uri. Na curtura semi-aerobbica cu un vulumi di 1 ml veni usata pi inoculari 30 ml di menzu M22 nna na buttiglia di vitru trasparenti univirsali a viti di 30 ml e arraggiata cu l'aggitazzioni (~50μmolm-2 s-1) pi 48 uri cu na forza magnètica sterili di stirring rod. Poi 30 ml di curtura foru inoculati cu circa 1 litru di curtura nne stissi cunnizzioni, ca fu usatu pi inoculari circa 9 litri di curtura illuminata a ~200 μmolm-2 s-1 pi 72 uri. Li cèlluli foru arricugghiuti cu centrifugazzioni a 7132 RCF pi 30 minuti, risuspinnuti nta ~10 ml di tris-HCl 20 mM (pH 8,0) e sarbati a -20°C nzinu a quannu nun ci serbia.
Doppu ca si sciogghi, agghiùnciri quarchi cristallu di disussiribbunucliasi I (Merck, Regnu Unitu), lisuzima (Merck, Regnu Unitu) e du' cumpressi inibbituri di prutiasi di l'oluenzima Roche (Merck, Regnu Unitu) ê cèlluli risuspinnuti. Nna na cellula a prissioni francisi di 20.000 psi (Aminco, USA), li celluli foru rutti di 8 a 12 voti. Doppu ca li cèlluli nun rutti e li detriti nun sulubbili foru livati ​​cu centrifugazzioni a 18.500 RCF pi 15 minuti a 4°C, la mimbrana fu pricipitata dû lisatu pigmintatu cu centrifugazzioni a 113.000 RCF pi 2 uri a 43.000°C. Scartari la frazziuni sulùbbili e risuspinniri la mimbrana culurata nta 100-200 ml di tris-HCl 20 mM (pH 8,0) e omugginizzari nzinu a quannu nun ci sunnu aggrigati visìbbili. La mimbrana suspinnuta fu ncubata nta 20 mM tris-HCl (pH 8,0) (Anatrace, USA) ca cuntinìa lu 2% (p/v) di β-DDM pi 1 ura ô scuru a 4°C cu n'ammiscatura dilicata. Poi centrifugari a 70°C pi dissolviri 150.000 RCF a 4°C pi 1 ura pi livari li residui nun sulubbili.
La mimbrana sulubbilizzanti dû ceppu ΔpufW fu applicata a na culonna di scanciu di joni di sifarosi DEAE di 50 ml cu tri vulumi di culonna (CV) di tampuni di ligami [20 mM tris-HCl (pH 8,0) ca cunteni 0,03% (p/v) β-DDM]. Lavari la culonna cu du' tampuni di ligami CV e poi lavari la culonna cu du' tampuni di ligami ca cuntenunu 50 mM NaCl. Lu cumplessu RC-LH116 fu eluitu cu nu gradienti liniari di 150 a 300 mM NaCl (ntà nu tampuni di ligami) ntà 1,75 CV e lu cumplessu di ligami ristanti fu eluitu cu nu tampuni di ligami ca cuntinìa 300 mM NaCl ntà 0,5 CV. Arricuogghiri lu spettru d'assuppamentu ntra 250 e 1000 nm, mantèniri la frazzioni cu nu rapportu d'assuppamentu (A880/A280) cchiù granni di 1 a 880 a 280 nm, dilujarilu du' voti nnô tampuni di ligami e usari n'autra vota la stissa prucidura nnâ culonna DEAE Nnâ purificazzioni. Diluiri li frazziuna cu prupurzioni A880/A280 cchiù auti di 1,7 e prupurzioni A880/A805 cchiù auti di 3,0, fari lu terzu giru di scanciu di joni, e mantèniri li frazziuna cu prupurzioni A880/A280 cchiù auti di 2,2 e prupurzioni A880/A805 cchiù auti di 0. Lu cumplessu parziarmenti purificatu fu cuncintratu a ~2 ml nna un filtru cintrifugu a tagghiu di pisu muliculari Amicon 100.000 (MWCO) (Merck, Regnu Unitu), e carricatu nna na culonna d'esclusioni di grannizza Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, Stati Uniti) ca cuntinìa nu tampuni di NaC e 200 ml 1,5 CV. Arricuogghiri li spettri d'assuppamentu dâ frazzioni di esclusioni di grannizza, e cuncintrari li spettri d'assuppamentu cu prupurzioni A880/A280 supra a 2,4 e prupurzioni A880/A805 supra a 5,8 a 100 A880, e usalli subbitu pâ priparazzioni o l'archiviazzioni dâ griglia criu-TEM nzinu a -8°C.
La mimbrana sulubbilizzanti dû ceppu PufW-His fu applicata a na culonna di 20 ml di sifarosi HisPrep FF Ni-NTA (20 mM di tris-HCl (pH 8,0) ca cunteni 200 mM di NaCl e 0,03% (p/p)) nnô tampuni IMAC (GECA). v) β-DDM]. La culonna fu lavata cu cincu CV di tampuni IMAC e poi cu cincu CV di tampuni IMAC ca cuntinìa 10 mM di istidina. Lu cumplessu nucliari fu eluitu dâ culonna cu cincu tampuni IMAC ca cuntinìanu 100 mM di istidina. La frazzioni ca cunteni lu cumplessu RC-LH114-W è cuncintrata a ~10 ml nna na serbatoiu ammiscatu dutatu di nu filtru Amicon 100.000 MWCO (Merck, Regnu Unitu), dilujata 20 voti cu nu tampuni di ligami, e poi agghiunciuta a 25 ml di tampuni DEAE b 'n anticipu. Lavari la culonna cu quattru tampuni di ligami CV, poi eluiri lu cumplessu ncapu a ottu CV ncapu a nu gradienti liniari di 0 a 100 mM NaCl (ntô tampuni di ligami), e li quattru CV ristanti cuntinenti 100 mM di tampuni di ligami Li cumplessi residui eluiti ncapu lu sori8de0. cchiù autu di 2,4 e lu rapportu A880/A805 cchiù àutu di 4,6 frazzioni foru cuncintrati a ~2 ml nta nu filtru cintrifugu Amicon 100.000 MWCO, e chini cu 1,5 CV IMAC 'n anticipu. 1,5 CV. Arricuogghiri li spettri d’assuppamentu dî frazziuna di grannizza-esclusioni e cuncintrari li spettri d’assuppamentu cu prupurzioni A880/A280 supra 2,1 e prupurzioni A880/A805 supra 4,6 a 100 A880, ca vennu usati subbitu pâ priparazzioni dâ griglia TEM cugghiuta o sarbati nzinu a -80°C.
Nu cungelaturi a mmirsioni Leica EM GP fu usatu pi priparari grigli TEM a vascia timpiratura. Lu cumplessu fu dilujatu nnô tampuni IMAC nzinu a A880 di 50, e poi 5μl foru caricati ncapu a na riti di ramu rivestita di carboniu QUANTIFOIL 1,2/1,3 scaricata di novu (Agar Scientific, Regnu Unitu). Ncubari la griglia a 20°C e umidità rilativa dû 60% pi 30 s, poi asciugàrila pi 3 s e poi smuntarila nta l’etanu liquidu a -176°C.
Li dati dû cumplessu RC-LH114-W foru riggistrati nnô eBIC (Centru di Biummagginazzioni Elettrònica) (Funti di Luci di Diamanti Britannica) cu nu micruscopiu Titan Krios, ca travagghia a na vurtaggiu acciliranti di 300 kV, cu n'ingrannimentu numinali di 130.000 enirgìa di Chosi di-2× Un Gatan 968 GIF Quantum cû rilevaturi di piccu K2 fu usatu pi riggistrari mmàggini ‘n modalità di cuntu pi arricogghiri dati. La grannizza dû pixel calibratu è 1,048 Å, e la prubabbilità di dosi è 3,83 e-Å-2s-1. Arricuogghìu la pillìcula nna 11 sicunni e la spartìu nna 40 parti. Usa l'aria rivestita di carboniu pi cuncintrari arrè lu micruscopiu, e poi arricogghiri tri film pi pirtusu. Ntô tutali, foru arricugghiuti 3130 film, cu valura di sfucatura ntra -1 e -3μm.
Li dati pû cumplessu RC-LH116 foru arricugghiuti usannu lu stissu micruscopiu ntô Labburatoriu di Biustruttura di Asterbury (Università di Leeds, Regnu Unitu). Li dati foru arricugghiuti ‘n modalità di cuntu cu n’ingrannimentu di 130 k, e la grannizza dî pixel fu calibrata a 1,065 Å cu na dosi di 4,6 e-Å-2s-1. La pillìcula fu rigistrata nna 12 sicunni e divisa nna 48 parti. Ntô tutali, foru arricugghiuti 3359 pillìculi, cu valura di sfucatura ntra -1 e -3μm.
Tuttu lu prucessu dî dati veni eseguitu nnô cunnuttu Relion 3.0 (42). Usa Motioncorr 2 (43) pi curriggiri lu muvimentu dû raggiu cu na pisantizza dâ dosi, e poi usa CTFFIND 4.1 (44) pi ditirminari lu paràmitru CTF (funziuni di trasfirimentu di cuntrastu). Li fotumicrugrafìi tìpici doppu sti fasi di prucissamentu nizziali su’ mustrati nnâ Figura 2. S16. Lu mudellu di silizzioni autumàtica veni giniratu silizziunannu manualmenti circa 250 pixel di 1000 particeḍḍi nna nu quatru di 250 pixel e senza na classificazzioni bidiminziunali (2D) di rifirimentu, rifiutannu accussì chiḍḍi classificazzioni ca suddisfanu la cuntaminazzioni dû campioni o nun hannu carattirìstichi discèrnibbili. Poi, la silizziuni autumàtica fu fatta pi tutti li micrufotugrafìi e lu RC-LH114-W era di 849.359 particeḍḍi e lu cumplessu RC-LH116 era di 476.547 particeḍḍi. Tutti li particeḍḍi scigghiuti subberu du’ giru di classificazzioni 2D nun di rifirimentu, e doppu ogni cursa, li particeḍḍi ca ncuntranu l’aria di carboniu, la cuntaminazzioni dû campiuni, nuḍḍi carattirìstichi ovvi o particeḍḍi fortimenti suvrapposti vennu rifiutati, purtannu a 772.033 (90,9%) e 359.678 particeḍḍi di classificazzioni pi D RC-LH114-W e RC-LH116 rispittivamenti. Lu mudeḍḍu di rifirimentu 3D nizziali fu giniratu usannu lu mètudu di discinnenza dû gradienti stucàsticu. Usannu lu mudeḍḍu nizziali comu rifirimentu, li particeḍḍi scigghiuti su’ classificati nta quattru catigurìi ‘n 3D. Usannu lu mudeḍḍu di sta catigurìa comu rifirimentu, fari na raffinazzioni 3D ncapu li particeḍḍi dâ catigurìa cchiù granni, poi usari lu filtru passa-vasciu di 15Å nizziali pi cummigghiari l’aria dû surventi, agghiùnciri 6 pixel di bordi morbidi, e post-prucissari li pixel pi curriggiri la funziuni di trasfirimentu supiriuri di Gatan K2 Mo. Pi lu nzemi di dati RC-LH114-W, stu mudeḍḍu nizziali fu canciatu livannu la dinsità forti ntê cunfini dâ maschera (scunnessa dâ dinsità cumplessa dû nùcliu nnâ Chimera UCSF). Li mudeḍḍi risurtanti (li risuluzzioni di RC-LH114-W e RC-LH116 su’ rispittivamenti 3,91 e 4,16 Å) vennu usati comu rifirimentu pû sicunnu giru di classificazzioni 3D. Li particeḍḍi usati su’ raggruppati nnâ classi 3D nizziali e nun cuntèninu na forti currilazzioni cû vicinatu. Suvrapposizzioni o mancanza di carattiristichi strutturali chiari. Doppu lu sicunnu giru di classificazzioni 3D, fu scigghiuta la catigurìa câ risuluzzioni cchiù auta [Pî RC-LH114-W, na catigurìa è 377.703 particeḍḍi (44,5%), pi RC-LH116, cci su’ sulu du’ catigurìi, quannu su’ alliniati 260.752 particeḍḍi. doppu la rutazzioni nizziali cu na diffirenza nica]. Li particeḍḍi scigghiuti vennu riestratti nna na scatula di 400 pixel e raffinati cu na raffinazzioni 3D. La màscara sulventi veni ginirata usannu lu filtru passa-vasciu nizziali di 15 Å, l'espansioni dâ mappa di 3 pixel e la màscara morbida di 3 pixel. Usannu lu raffinamentu CTF pi particeḍḍa, la currizzioni dû muvimentu pi particeḍḍa e lu sicunnu giru di raffinamentu CTF pi particeḍḍa, lu raffinamentu 3D, la mascherazzioni dû surventi e lu post-prucissuri vennu fatti doppu ogni passaggiu pi raffinari ultiriurmenti la trama risurtanti. Usannu lu valuri di tagghiu FSC (Cufficenti di Currilazzioni dâ Scoccia di Fourier) di 0,143, li risuluzzioni dî mudeḍḍi finali di RC-LH114-W e RC-LH116 su’ rispittivamenti 2,65 e 2,80Å. A curba FSC dû modellu finali è mustrata nnâ Figura 2. S17.
Tutti li siquenzi prutìichi vennu scaricati di UniProtKB: LH1-β (PufB; ID UniProt: Q6N9L5); LH1-α (PufA; Uniprutificazzioni: Q6N9L4); RC-L (PufL; ID Unipruttu: O83005); RC-M (PufM; ID Unipruttu: A0A4Z7); RC-H (PuhA; ID Unipruttu: A0A4Z9); Prutiìna-W (PufW; ID Uniprutìna: Q6N1K3). Lu mudeḍḍu SWISS (45) fu usatu pi custruiri nu mudeḍḍu d'omoluggìa di RC, ca cunteni li siquenzi prutìichi di RC-L, RC-M e RC-H e la struttura di cristallu di Rba. sfiroidi RC fu usatu comu mudeḍḍu (ID PDB: 5LSE) (46). Usa lu strumentu "mappa adatta" nnâ Chimera UCSF pi adattari lu mudeḍḍu giniratu â mappa (47), migghiurari la struttura prutìica e lu cufatturi [4×BChl a (nomu dû risiduu dâ bibbliuteca di munòmiri = BCL), 2×BPh a (BPH), unu o du' tipi di UQ10 (U10), unu nun-heme) 3,4-diidruesacarbunilculina (QAK)] usa Coot (48) pi junciri. Siccomu QAK nun è dispunìbbili nnâ bibbliuteca dî munòmiri, fu paramitrizzatu usannu lu strumentu eLBOW nna PHENIX (49).
Appoi, fu custrujuta la sutunità LH1. Accuminciannu, lu strumentu di custruzziuni autumàtica ntà PHENIX (49) fu usatu pi custrujiri autumàticamenti na parti dâ siquenza LH1 usannu la mappa e li siquenzi dî prutiini LH1-α e LH1-β comu input. Scegghiri la sutunità LH1 cchiù cumpleta, estrarla e carricala ntà Coot, agghiùnciri manualmenti la siquenza mancanti e raffinari manualmenti tutta la struttura prima di agghiùnciri du BCl a (BCL) e na spirilloxantina (CRT) [sicunnu li Rps rilivanti La dinsità dû cuntinutu carutinoidi LH1 e lu canusciutu. Speci (17)]. Cupia la suttanità LH1 cumpleta, e usa lu "Strumentu di mappa di attraccamentu" dâ Chimera UCSF pi attraccari nna l'aria nun mudeḍḍu vicinu di dinsità LH1, e poi raffinarila 'n Coot; ripètiri lu prucessu nzinu a quannu tutti li sutunità LH1 sunnu mudillati. Pi la struttura RC-LH114-W, estraennu la dinsità nun allocata ntô Coot, la prutiina è sigmintata dî cumpunenti nun prutìici ristanti ntâ mappa dâ Chimera USCF e lu strumentu Autobuild veni usatu pi stabbiliri lu mudeḍḍu nizziali e la mudeḍḍaggiu dî suttanità ristanti (pruteina-W). Ntâ FINICI (49). Aggiungi siquenzi mancanti ô mudeḍḍu risurtanti nna Coot (48), e poi raffina manualmenti l'intera sutunità. La dinsità non allocata ristanti s'adatta â cumminazziuni dî lipidi (ID dâ bibbliuteca dû munòmiru PDB di CDL = CDL, POPC = 6PL e POPG = PGT), ditirggenti β-DDM (LMT) e muleculi UQ10 (U10). Usa l’uttimizzazzioni PHENIX (49) e l’ottimizzazzioni manuali di Coot (48) pi pirfizziunari lu mudeḍḍu nizziali cumpletu nzinu a quannu li statistichi dû mudeḍḍu e la qualità visiva dâ misura nun ponnu èssiri migghiurati ultiriurmenti. Pi finiri, usa LocScale (50) pi affilari la mappa lucali, e poi fari autri cicli di mudeḍḍaggiu dâ dinsità nun allocata e uttimizzazzioni autumàtica e manuali.
Li rispittivi peptidi, cofatturi e autri lipidi e chinuni ancorati ntà li sò dinsità rispittivi sunnu mustrati nté figuri 1 e 2. S18 nzinu a S23. Li ‘nformazzioni statistichi dû modellu finali sunnu mustrati nnâ tabbella S1.
Salvu ca nun fussi spicificatu diversamenti, li spettri d’assuppamentu UV/Vis/NIR foru arricugghiuti ncapu a nu spettrufotòmetru Cary60 (Agilent, USA) a ntirbaḍḍi di 1 nm di 250 nm a 1000 nm e nu tempu di ntigrazzioni di 0,1s.
Dilùiri u campioni nnâ cuvetta ri quartzu cû percorsu ri 2 mm nzinu a A880 ri 1 e arricuogghiri u spettru ri assorbimentu ntra 400 e 1000 nm. Li spettri dicròici circulari foru arricugghiuti ncapu a nu spettrupularìmitru Jasco 810 (Jasco, Giappuni) a ntirbaḍḍi di 1 nm ntra 400 nm e 950 nm a na vilucità di scanziuni di 20 nm min-1.
Lu cufficenti d'estinziuni mulari è ditirminatu dilujennu lu cumplessu nucliari a n'A880 di circa 50. Diluja lu vulumi di 10 μl ntà 990 μl di tampuni di ligami o mitanolu e arricuogghi subbitu lu spettru d'assuppamentu pi ridduciri ô minimu la digradazziuni di BChl. Lu cuntinutu di BChl di ogni campioni di mitanolu fu calculatu dû cufficenti di estinzioni a 771 nm di 54,8 mM-1 cm-1 e lu cufficenti di estinzioni fu ditirminatu (51). Divìdiri la cuncintrazzioni misurata di BChl pi 32 (RC-LH114-W) o 36 (RC-LH116) pi additirminari la cuncintrazzioni cumplessa nucliari, ca poi veni usata pi additirminari lu spettru d'assorbimentu dû stissu campioni arricugghiutu ntô cufficenti di estinzioni dû tampuni. parallelu. Furu pigghiati tri misurazzioni ripituti pì ogni campioni e pû càrculu fu usatu l'assorbimentu mediu dû massimu ri BChl Qy. Lu cufficenti d'estinzioni di RC-LH114-W misuratu a 878 nm eni 3280±140 mM-1 cm-1, mentri lu cufficenti d'estinzioni di RC-LH116 misuratu a 880 nm eni 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 fu quantificatu sicunnu lu mètudu di (52). ‘N brevi, la HPLC a fasi nversa (RP-HPLC) fu fatta usannu lu sistema HPLC Agilent 1200. Sciogghi circa 0,02 nmol di RC-LH116 o RC-LH114-W nta 50 μl di mitanolu:clorufurmu 50:50 ca cunteni lu 0,02% (p/v) di cloruru di fèrricu, e iniettari l'ultrasfera di Beckman Coulter pri-equilibbrata nta mm1 40°C nnô sulventi HPLC (80:20 mitanolu:2-prupanolu) ncapu a na culonna di ×25 cm. Eseguiri l'eluzzioni isucràtica nna un sulventi HPLC pi cuntrullari l'assuppamentu a 275 nm (UQ10), 450 nm (carutinòidi) e 780 nm (BChl) pi 1 ura. Lu piccu nnô cromatogramma di 275 nm a 25,5 minuti fu ntigratu, ca nun cuntinìa autri cumposti rilivàbbili. L’aria ntigrata veni usata pi carculari la quantità mulari di UQ10 estratta cu rifirimentu â curba di calibrazzioni calculata di l’iniezziuni di standard puri di 0 a 5,8 nmol (Figura S14). Ogni campioni fu analizzatu ‘n tri rèplichi e l'erruri ripurtatu currispunni â DS dâ media.
Na suluzziuni ca cunteni lu cumplessu RC-LH1 cu n'assorbimentu massimu di Qy di 0,1 fu priparata cu 30 μM di citucrumu c2 dû cori di cavaḍḍu riduttu (Merck, Regnu Unitu) e di 0 a 50 μMUQ2 (Merck, Regnu Unitu). Tri campioni ri 1 ml foru priparati a ogni cuncintrazzioni ri UQ2 e ‘ncubati duranti a notti nnô scuru a 4°C pì assicurari n’adattamentu cumpletu ô scuru prima dâ misurazzioni. La suluzzioni fu carricata nna un spettrufotòmetru mudulari OLIS RSM1000 dutatu di na griglia a linia di ciamma/500 di 300 nm, firitòi di ngressu di 1,24 mm, firitòi di menzu di 0,12 mm e di uscita di 0,6 mm. Nu filtru a passaggiu longu 600 nm è misu nnâ l’ingressu dû fotutubbu dû campioni e dû fotumurtiplicaturi di rifirimentu pi esclùdiri la luci di eccitazzioni. L'assorbimentu fu monitoratu a 550 nm cu nu tempu di ntigrazziuni di 0,15 s. La luci di eccitazzioni veni jittata dû LED M880F2 di 880 nm (Diodu emittenti di luci) (Thorlabs Ltd., Regnu Unitu) attraversu un cavu a fibbra ottica a ntinsità dû 90% attraversu un cuntrullaturi DC2200 (Thorlabs Ltd., Regnu Unitu) e veni jittata â funti di luci di n’àngulu di 9°0. U raggiu ri misurazzioni è oppostu ô specchiu pì riturnari qualegghiè luci ca ‘n princìpiu nun fussi assurbita dô campioni. Cuntrullari l'assorbimentu 10 s prima di l'illuminazzioni di 50 s. Poi l'assorbimentu fu ultiriurmenti monitoratu pi 60 s ntò scuru pi valutari la misura in cui lu chinololu arridduci spuntaneamenti lu citucrumu c23 + (vidi Figura S8 pî dati grezzi).
Li dati foru elabburati adattannu 'na frequenza ‘nizziali liniari ntra 0,5 e 10 s (a sicunna dâ cuncintrazzioni ri UQ2) e mediannu li tassi ri tutti e tri li campioni a ogni cuncintrazzioni ri UQ2. La cuncintrazzioni di RC-LH1 calculata dû rispittivu cufficenti di estinzioni fu usata pi cummirtiri la prubabbilità nna l'efficienza catalìtica, tracciata nna Origin Pro 2019 (OriginLab, USA), e adattata ô mudeḍḍu Michaelis-Menten pi ditirminari li valura apparenti di Km e Kcat.
Pî misurazzioni ri assorbimentu transienti, u campioni RC-LH1 fu diluitu a ~2 μM nnô tampuni IMAC ca cuntinìa 50 mM ri ascurbatu ri sòdiu (Merck, USA) e 0,4 mM ri tirbutina (Merck, USA). L'àcitu ascòrbicu è usatu comu dunaturi di elittruna sacrificiali e lu tert-butaclofenu è usatu comu inibbituri QB pi assicuràrisi ca lu dunaturi RC principali arrimani ridduttu (azzoè nun fotussidizzatu) duranti tuttu lu prucessu di misurazzioni. Circa 3 ml ri campioni vennu agghiunciùti â 'na cellula rutativa su misura (circa 0,1 m ri diamitru, 350 RPM) cu 'na lunghizza ri percorsu ottico ri 2 mm pì assicuràrisi ca u campioni nnô percorsu laser havi tiempu sufficienti pì l’adattamentu scuru ntra ‘mpulsi ri eccitazzioni. Usa impulsi laser di ~100 fs pi amplificari lu sistema laser Ti: Zaffiru (Spectra Physics, USA) pi eccitari lu campiuni a 880 nm a na friquenza di ripitizzioni di 1 kHz (20 nJ pi NIR o 100 nJ pi Vis). Prima ri arricùogghiri li dati, espòniri u campioni â luci ri eccitazzioni pì circa 30 minuti. L'esposizzioni pruvuca l'inattivazzioni dâ QA (forsi riducennu la QA na vota o du' voti). Ma si prega di notari ca chistu prucessu è rivirsìbbili picchì doppu nu pirìudu longu ri adattamentu scuru, RC turnarà pianu pianu â attività QA. Nu spettròmitru Helios (Sistemi ultraveloci, USA) fu usatu pi misurari li spettri transienti cu nu tempu di ritardu di -10 a 7000 ps. Usa lu prugramma Surface Xplorer (Sistemi Ultrafast, USA) pi smuntari li nzemi di dati, poi junciri e standardizzari. Usa lu pacchettu prugrammàticu CarpetView (Light Conversion Ltd., Lituania) pi usari lu nzemi di dati cumminatu p’aviri spettri diffirinziali lijati ô dicadimentu, o usa na funzioni ca cumprenni cchiù espunenti câ risposta dû strumentu pi adattàrisi a l’evuluzzioni spettrali a lunghizza d’unna sìngula nta Urìggini (Urìggini USA).
Comu dittu supra (53), fu priparatu na pillìcula fotusintètica ca cunteni cumplessu LH1 senza sia l'antinna RC ca chiḍḍa piriferica LH2. La mimbrana fu dilujata nta 20 mM tris (pH 8,0) e poi carricata nta na cuvetta di quartzu cu nu percorsu ottico di 2 mm. N’impulsu laser ri 30 nJ fu usatu pì eccitari u campioni a 540 nm cû nu tempu ri ritardu ri -10 a 7000 ps. Prucissari lu nzemi di dati comu discrittu pi Rps. campioni di pal.
La mimbrana fu pillettata cu centrifugazzioni a 150.000 RCF pi 2 uri a 4°C, e poi l'assorbimentu a 880 nm fu risuspinnutu nta 20 mM tris-HCl (pH 8,0) e 200 mM NaCl. Sciogghiri la mimbrana ammiscannu lentamenti ntô 2% (p/v) β-DDM pi 1 ura ô scuru a 4°C. Lu campioni fu diluitu ‘n 100 mM ri carbunatu ri trietilammoniu (pH 8,0) (TEAB; Merck, Regnu Unitu) nzinu a 'na cuncintrazzioni prutìica ri 2,5 mg ml-1 (analisi Bio-Rad). Furu fatti ultiriuri prucissiuni cû mètudu pubblicatu prima (54), accuminciannu câ diluizzioni di 50 μg di prutiini nta nu tutali di 50 μl di TEAB ca cuntinìa l'1% (p/v) di lauratu di sodiu (Merck, Regnu Unitu). Doppu la sunicazzioni pi 60 s, fu arridduttu cu 5 mM tris(2-carbussietil)fusfina (Merck, Regnu Unitu) a 37°C pi 30 minuti. Pî S-alchilazzioni, ‘ncubari u campioni cu 10 mM ri mitilu S-mitiltiomitanusulfunatu (Merck, Regnu Unitu) e agghiùncirilu dâ suluzzioni ri riserva ri isuprupanolu ri 200 mM pì 10 minuti a timpiratura ambienti. La diggistiuni prutiulitica fu fatta agghiuncennu 2 μg di miscela di tripsina/endupruteinasi Lys-C (Promega UK) e ncubata a 37°C pi 3 uri. Lu surfattanti lauratu fu estrattu agghiuncennu 50 μl di acitatu di etili e 10 μl di àcitu trifluoruacèticu di gradu LC (TFA; Thermo Fisher Scientific, Regnu Unitu) e virtizzannu pi 60 s. La siparazzioni di fasi fu prumuvuta dâ centrifugazzioni a 15.700 RCF pi 5 minuti. Secunnu lu prutocollu dû prudutturi, na culonna di spin C18 (Thermo Fisher Scientific, Regnu Unitu) fu usata pi aspirari e disalari cu cura la fasi cchiù vascia ca cunteni lu peptidi. Doppu l’asciugatura cû centrifugazzioni ô votu, u campioni fu dissoltu nnô 0,5% di TFA e nnô 3% di acitunitrìli e 500 ng foru analizzati câ cromatografìa RP a nanuflussu accuppiata câ spettrumitrìa di massa usannu li paramitri dû sistema dittagghiati ‘n pricidenza.
Usa MaxQuant v.1.5.3.30 (56) pi idintificari e quantificari li prutiini pi circari Rps. lu databbasi dû prutioma dû palustris. Li dati prutiòmici dâ spettrumitrìa di massa foru dipusitati nna l'Allianza ProteomeXchange attraversu lu ripusitòriu dû cumpagnu PRIDE (http.
Pî l’anàlisi cu RPLC accuppiata câ spettrumitrìa di massa di junizzazzioni elettruspray, lu cumplessu RC-LH1 fu priparatu di Rps di tipu sarvaggiu. Usannu lu mètudu pubblicatu prima (16), la cuncintrazzioni prutìica prudutta nne cèlluli di palustris era di 2 mg ml-1 ntà 20 mM di Hepes (pH 7,8), 100 mM di NaCl e 0,03% (p/v) β- (analisi Bio-Rad) ) DDM. Secunnu lu prutucolu dû prudutturi, usa lu kit di purificazzioni 2D (GE Healthcare, USA) pi estrarri 10 μg di prutiini cû mètudu di pricipitazzioni, e dissolvi lu pricipitatu nta 20 μl di àcitu furmicu (FA) ô 60% (v/v), 20% (v/v) di acitunitrili e acqua (20%). Cincu micrulitri foru analizzati cû RPLC (Dionex RSLC) accuppiatu câ spettrumitrìa di massa (Maxis UHR-TOF, Bruker). Usari na culonna MabPac di 1,2 x 100 mm (Thermo Fisher Scientific, Regnu Unitu) pâ siparazzioni a 60°C e 100 μlmin -1, cu nu gradienti di l'85% (v/v) sulventi A [0,1%(v/v) FA e 0,02%(v/v) nnô 90%(v/v) di acitunitrilu TFA] Usannu la funti di junizzazzioni elettruspray standard e li paràmitri di basi pi cchiù assai di 60 minuti, lu spettrumètru di massa utteni di 100 a 2750 m/z (rapportu massa-carica). Cu l'aiutu dû strumentu FindPept dû purtali di risursi biunfurmàtichi ExPASy (https://web.expasy.org/findpept/), mappa lu spettru di massa ê sutunità dû cumplessu.
Li cèlluli foru crisciuti pi 72 uri sutta 100 ml di luci NF-vascia (10 μMm-2 s-1), media (30 μMm-2 s-1) o auta (300 μMm-2 s-1). Mediu M22 (mediu M22 unni lu surfatu d'ammuniu è omissu e lu succinatu di sodiu è scanciatu cu l'acitatu di sodiu) nna na buttiglia a viti di 100 ml (23). Nna cincu cicli di 30 s, pirlini di vitru di 0,1 micru foru pirlinati a na prupurzioni di vulumi di 1:1 pi lisari li cèlluli e arrifriddati ncapu lu ghiacciu pi 5 minuti. La materia nun sulubbili, li cèlluli nun rutti e li perli di vitru foru livati ​​cu centrifugazzioni a 16.000 RCF pi 10 minuti nna na micrucentrifuga di bancu. La mimbrana fu siparata nta nu ruturi Ti 70,1 cu 100.000 RCF nta 20 mM tris-HCl (pH 8,0) cu nu gradienti di saccarosiu dû 40/15% (p/p) pi 10 uri.
Comu discrittu ntô nostru travagghiu pricidenti, l'immunudilevamentu dû tag His ncapu PufW (16). ‘N brevi, lu cumplessu dû nùcliu purificatu (11,8 nM) o la mimbrana ca cunteni la stissa cuncintrazzioni di RC (ditirminata di l'ossidazzioni livannu lu spettru di diffirenza ridutta e abbinannu lu càrricu ncapu lu gel culuratu) nnô tampuni di càrricu SDS 2x (Merck, UK) dilujatu du' voti. Li proteini foru siparati ncapu na rèplica dû gel NuPage dû 12% (Thermo Fisher Scientific, Regnu Unitu). Nu gel fu culuratu cû blu brillanti di Coomassie (Bio-Rad, Regnu Unitu) pi càrricari e visualizzari la sutunità RC-L. La prutiina dû sicunnu gel fu trasfiruta â mimbrana di fluoru di polivinilidenu attivatu cû mitanolu (Thermo Fisher Scientific, Regnu Unitu) pi l'immunuassaggiu. La mimbrana PVDF fu bluccata nta 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0,2% (v/v) Tween-20 e 5% (p/v) di latti scumatu ‘n pulviri, e poi ncubata cu l’anticorpu primariu anti-His (ntô tampuni mH0p 7,6), 150 mM di NaCl e 0,05% (v/v) di Tween-20] nta 1:1000 A190-114A, Labburatori di Bitili, USA) pi 4 uri. Doppu lu lavaggiu 3 voti pi 5 minuti nta nu tampuni d'anticorpi, la mimbrana fu cumminata cu l'anticorpu sicunnariu anti-surciu perossidasi dû ravanu (Sigma-Aldrich, Regnu Unitu) (dilujatu 1:10.000 nta nu tampuni di anticorpi) W ncubari pi cunsentiri lu rilevamentu (5 minuti doppu 3 lavaggi ntô tampuni di anticorpi chimiscenti CEST2) (Cyanagen, Italia) e Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Regnu Unitu).
Disignannu la distribbuzzioni di ntinsità di ogni gel culuratu o corsia di l'immunuassaggiu, ntigrannu l'aria sutta lu piccu e carculannu lu rapportu di ntinsità di RC-L (gel culuratu) e Protein-W (immunuassaggiu), nta ImageJ (57) prucissari l'immaggini. Chisti rapporti foru cummirtuti ‘n rapporti mulari suppunennu ca lu rapportu RC-L e prutiìna-W ntô campioni puru RC-LH114-W era 1:1 e nurmalizzannu di cunsiguenza tuttu lu nzemi di dati.
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David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Hirmain, Christ
La struttura a risuluzzioni auta dû cumplessu dâ trappula di luci 1 ntô centru di riazzioni duna novi ntuizziuni ncapu li dinàmichi dî chinuni.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Hirmain, Christ
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©2021 Associazzioni ‘miricana pû prugressu dâ scienza. tutti li diritti riservati. AAAS è nu cumpagnu di HINARI, AGORA, OARE, CORO, CLOCKSS, CrossRef e CONTATOR. Avanzamenti dâ Scienza ISSN 2375-2548.