Prisenti *Indirizzu attuali: Colonia 50931, Girmania, Ricerca dû Cluster di Eccillenza di Colonia supra la Risposta ô Stress Cellulari nnî Malatìi Lijati ô ‘nvicchiamentu (CECAD).
La neurudiginirazziuni dî malatìi mitucondriali è cunsidirata irrivirsibbili picchì la plasticità metabolica dî neuruni è limitata, ma l'effettu dâ disfunziuni mitucondriali ntà l'autonumìa cellulari dû metabbulismu neuruniali ntò corpu è picca capitu. Ccà, prisintamu lu pruteoma cellulari spicificu dî neuruni di Purkinje cu na carenza prugrissiva di OXPHOS causata di dinamichi di fusiuni mitucondriali interrutti. Scuprìumu câ disfunziuni mitucondriali attivau nu mutamentu prufunnu ntò campu dâ prutiomica, purtannu â fini all'attivazziuni siquinziali di programmi metabbolici pricisi prima dâ morti dâ cellula. Inaspittatamenti, additirminamu l'induzziuni ovvia dâ piruvatu carbussilasi (PCx) e autri perossidasi ligati ô supplimentu dî ntirmidi dû ciclu TCA. L'inibbizziuni dû PCx aggravau lu stress ossidativu e la neurudiginirazziuni, ca innica ca l'aterusclerosi avi n'effettu prutittivu nté neuruni senza OXPHOS. Lu ristauru dâ fusiuni mitucondriali nté neuruni terminalmenti diginirati inverti completamenti sti caratteristichi metabbolici, evitannu accussì la morti cellulari. Li nostri risultati identificunu percorsi scanusciuti prima ca cunferisciunu risistenza â disfunziuni mitucondriali e mustranu câ neurudiginirazziuni pò essiri invertita puru ntà li fasi tardivi dâ malatia.
Lu rolu cintrali dî mitucondri ntò mantinimentu dû metabbulismu di l'energia neurunali è suttaliniatu dî sintomi neuruloggici ampi assuciati ê malatìi mitucondriali umani. La maggiuranza di sti malatìi sunnu causati dî mutazziuni ginètichi ca regulunu l'esprissiuni ginètica mitucondriali (1, 2) o la distruzziuni ginètica ligata ê dinamichi mitucondriali, ca nfruenzunu indirettamenti la stabbilità dû DNA mitucondriali (mtDNA) (3, 4). Lu travagghiu nté mudelli armali mustràu ca comu risposta â disfunziuni mitucondriali nté tissuti circustanti, li vie metabolichi cunservatrici (5-7) ponnu essiri attivati, dunannu accussì ntuizziuni mpurtanti ntà patuginisi di sti malatìi cumplessi. Ntô cuntrariu, la nostra cumprinsiuni dî canciamenti metabbolici di spicifici tipi di celluli causati dû fallimentu ginirali dâ produzziuni di l'adenosina trifusfatu (ATP) mitucondriali ciriveḋḋu è funnamintali (8), enfatizzannu la necessità d'identificari l'obbiettivi terapeutici ca ponnu essiri usati pi priviniri o priviniri li malatìi. Privìniri la neurudigginirazziuni (9). La mancanza d'informazziuni è lu fattu ca li celluli nirvusi sunnu ampiamenti cunsidirati aviri na flissibbilità metabolica assà limitata rispettu ê tipi di celluli dî tissuti circustanti (10). Vistu ca sti celluli jocunu nu rolu cintrali ntà coordinazziuni dâ furnitura di metabboliti ê neuruni pi prumòviri la trasmissiuni sinattica e rispunniri ê cunnizziuni di firiti e malatìi, l'abbilità d'adattari lu metabbulismu cellulari ê cunnizziuni difficili dû tissutu ciriveḋḋu è quasi limitata ê celluli gliali (11-14). Nortri, l'eterogginità cellulari inerenti dû tissutu ciriveḋḋu ostacula assà lu studiu dî canciamenti metabbolici ca si virificanu ntà spicifici suttagruppi neuruni. Comu risultatu, si sapi picca dî cunsiquenzi cellulari e metabolichi esatti dâ disfunziuni mitocondriali nté neuruni.
Pi capiri li cunsiquenzi metabolichi dâ disfunziuni mitucondriali, isulamu li neuruni di Purkinje (PN) ntà diversi fasi di neurudiginirazziuni causata dâ distruzziuni dâ fusiuni dâ mimbrana esterna mitucondriali (Mfn2). Puru si li mutazziuni di Mfn2 ntà l'umani sunnu assuciati a na forma di neurupatia sinsuriali muturi riditaria canusciuta comu tipu 2A di Charcot-Marie-Tooth (15), la distruzziuni cunnizziunata di Mfn2 nté surci è n'induzziuni ben arricanusciuta dâ disfunziuni dâ fosfurilazziuni di l'ossidazziuni (OXthoPHOS). Li vari suttatipi niurunali (16-19) e lu finutipu neurudiginiritivu ca risurta sunnu accumpagnati di sintomi neuruloggici prugrissiva, comu li disturbi dû muvimentu (18, 19) o l'atassia ciriveḋḋa (16). Usannu na cumminazziuni di prutiomica quantitativa senza etichetti (LFQ), metabbulumica, immagginazziuni e mètudi viruloggici, mustramu câ neurudiginirazziuni prugrissiva innuci fortimenti la piruvatu carbussilasi (PCx) e autri fatturi coinvolti ntà l'arteriusclerosi dî PN in vivo L'esprissiuni di l'enzimi. Pi virìficari la rilevanza di chistu ritrovamentu, spicificamenti rigulamu l'esprissiuni di PCx ntà li PN cu dificienza di Mfn2 e attruvamu ca st'opirazziuni aggravau lu stress ossidativu e accilirau la neurudiginirazziuni, pruvannu accussì ca l'azoospermia cunferisci l'adattabbilità metabbolica dâ morti cellulari. L'esprissiuni grave di MFN2 pò salvari completamenti la digginirazziuni tirminali PN cu na carenza grave di OXPHOS, nu cunsumu massicciu di DNA mitucondriali e na riti mitucondriali apparentimenti rutta, ca enfatizza ultiriurmenti ca sta forma di neurudiginirazziuni pò puru ricupirari ntà fasi avanzata dâ malatia cellulari.
Pi visualizzari li mitucondri ntà li PN knockout Mfn2, usamu nu ceppu di surciu ca pirmetti ê mitucondri dipinnenti di Cre di mirari l'esprissiuni Cre dâ prutiina fluoriscenti gialla (YFP) (mtYFP) (20) e cuntrullamu la morfuluggìa mitucondriali in vivo. Scuprimu câ distruzziuni dû geni Mfn2 nté PN purtava â divisiuni graduali dâ riti mitucondriali (Figura S1A) e lu primu canciamentu fu truvatu a 3 simani d'età. Ô cuntrariu, la digginirazziuni sustanziali dû stratu cellulari PN, comu addimustratu dâ perdita di l'immunucultura di Calbindina, non accuminciàu nzinu a 12 simani d'età (Figura 1, A e B). Lu disabbinamentu di tempu tra li primi canciamenti ntà morfuluggìa mitucondriali e l'inizziu visibbili dâ morti neurunali ci spinciu a studiari li canciamenti metabbolici attivati ​​dâ disfunziuni mitucondriali prima dâ morti cellulari. Sviluppamu na stratiggìa basata ncapu la scelta dî cèlluli attivati ​​dâ fluuriscenza (FACS) pi isulari lu PN ca esprimi YFP (YFP+) (Figura 1C) e ntê surci di cuntrollu (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), di seguitu chiamatu CT1BRL (Figura 1C). L'ottimizzazziuni dâ stratiggìa di cancellazziuni basata ncapu l'intinsità rilativa dû signali YFP ci cunzenti di purificari lu corpu YFP+ (YFPhigh) di PN di non-PN (YFPneg) (Figura S1B) o frammenti assoni/dindritici fluoriscenti putativi (YFPlow; Figura S1D cunfirmata di micrufigura, a manca). Pî virìficari l'identità dâ populazziuni classificata, cunnuciemu la prutiomica LFQ e poi l'analisi dî cumpunenti principali e attruvamu ca c'è na siparazziuni chiara tra li celluli YFPhigh e YFPneg (Figura S1C). Li celluli YFPhigh mustraru n'arricchimentu nettu di marcaturi PN canusciuti (azzoè Calb1, Pcp2, Grid2 e Itpr3) (21, 22), ma nuḋḋu arricchimentu di pruteini cumunimenti esprissi nté neuruni o autri tipi di celluli (Figura 1D) ). Nu cunfrontu ntra campioni nnî cèlluli YFPhigh classificati arricugghiuti nnî spirimenti ‘nnipinnenti mustrò nu coefficienti ri currilazzioni> 0,9, dimustrannu 'na bona riproducibbilità ntra rèplichi biològgici (Figura S1E). ‘n riassuntu, chisti dati cunvalidàru u nostru pianu pì l’isolamentu acutu e spicìficu ri PN fattibbili. Siccomu lu sistema cunnutturi L7-cre usatu pruvoca la ricumminazziuni musaica ntà prima simana doppu lu partu (23), accuminciamu a ammazzari li surci di CTRL e cunnizziunati (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) arricuogghiri li neuruni. Doppu ca la ricumminazziuni è cumplitata, si chiama Mfn2cKO a 4 simani d'età. Comu puntu finali, scigghiemu 8 simani d'età quannu lu stratu PN era ancora intattu nunustanti li frammenti mitucondriali chiari (Figura 1B e Figura S1A). Ntô totali, quantificamu nu tutali di 3013 prutiini, di cui circa lu 22% si basava ncapu l'annutazziuni MitoCarta 2.0 basati ncapu lu prutioma mitucondriali comu mitucondri (Figura 1E) (Figura 1E) (24). L'analisi di l'esprissiuni ginètica diffirinziali fatta â simana 8 mustrò ca sulu lu 10,5% di tutti li proteini avìanu canciamenti significativi (Figura 1F e Figura S1F), di cui 195 proteini èrunu sutta-regulati e 120 proteini èrunu supra-regulati (Figura 1F). Si va a nutari ca l'"analisi dî percorsi innovativi" di stu nzemi di dati mustra ca li geni espressi diffirinziarmenti appartenunu principarmenti a nu nzemi ristrittu di percorsi metabbolici spicifici (Figura 1G). È ntirissanti ca, puru si la sutta-rigulazziuni dî percorsi ligati a l'OXPHOS e la signalazziuni dû calciu cunfirma l'induzziuni dâ disfunziuni mitucondriali nté PN dificienti di fusiuni, autri catigurìi ca pigghiunu principalmenti lu metabbulismu di l'amminuacidi sunnu assà rigulati, ca è in linia cû metabbulismu mitucondriali P ca si virifica. Lu ricabblaggiu è cuirenti. disfunzioni.
(A) Fotugrafìi cunfucali rapprisintanti dî sizziuni ciriveḋḋi dî surci CTRL e Mfn2cKO ca mustranu na pèrdita prugrissiva di PN (calbindina, grigiu); li nuclii foru cuntrastati cu DAPI. (B) Quantificazzioni ri (A) (analisi a sensu unidirezziunali dâ varianza, ***P<0,001; n = 4 a 6 circhi ri tri surci). (C) Flussu ri travagghiu spirimentali. (D) Distribbuzzioni dâ mappa di caluri dî marcaturi spicìfici di Purkinje (supra) e autri tipi di cèlluli (ntô menzu). (E) Diagramma di Venn ca mustra lu nummuru di pruteini mitucondriali identificati ntà PN classificata. (F) Graficu dû vulcanu dî prutiini espressi diffirinziarmenti nté neuruni Mfn2cKO a 8 simani (valuri di tagghiu di significanza di 1,3). (G) L'analisi dû percorsu dâ criatività mustra li cincu percorsi cchiù mpurtanti di rigulazziuni supra (russa) e rigulazziuni sutta (blu) ntô PN Mfn2cKO classificatu comu 8 simani. Vistu lu liveḍḍu d’esprissiuni mediu di ogni proteina truvata. Mappa di caluri ‘n scala di grici: valuri P ajustatu. ns, nun è mpurtanti.
Li dati prutiomici mustraru ca l'esprissiuni pruteica dî cumplessi I, III e IV diminuìu a picca a picca. Li cumplessi I, III e IV cuntinìunu tutti suttanità essinziali cudificati cû mtDNA, mentri lu cumplessu II, ca era sulu cudificatu nucliari, non fu nfruenzatu (Figura 2A e Figura S2A). . Coerenti cchî risultati dâ prutiomica, l'immunuistochimica dî sizziuni dî tissuti ciriveḋḋi mustràu ca lu livellu di sutunità MTCO1 (suttunità citucrumu C ossidasi mitucondriali 1) dû cumplessu IV ntà PN diminuìu a picca a picca (Figura 2B). La sutunità cudificata cû mtDNA Mtatp8 fu assà ridutta (Figura S2A), mentri lu livellu dû statu stazzionariu dâ sutunità sintasi ATP cudificata nucliari ristau senza canciamenti, ca è coerenti cû cumplessu F1 dû suttaassimblaggiu stàbbili canusciutu dâ sintasi ATP quannu l'esprissiuni mtDNA è stàbbili. La furmazzioni è coerenti. Ntirrumpiri (7). La valutazziuni dû liveḍḍu di mtDNA ntà li PN Mfn2cKO urdinati cu na riazziuni a catina dâ polimirasi 'n tempu riali (qPCR) cunfirmò la diminuzziuni graduali dû nummuru di copi di mtDNA. Ô cunfrontu dû gruppu di cuntrollu, a 8 simani d'età, sulu circa lu 20% dû livellu di mtDNA fu mantinutu (Figura 2C). Coerenti cu sti risultati, la culurazziuni dû micruscopiu cunfucali dî PN Mfn2cKO pi rilevari lu DNA mustra lu cunsumu dipinnenti dû tempu dî nucliotidi mitucondriali (Figura 2D). Scuprimu ca sulu certi cannidati coinvolti ntà digradazziuni dî proteini mitucondriali e la risposta ô stress furu supra-rigulati, inclusi Lonp1, Afg3l2 e Clpx e li fatturi d'assimblaggiu cumplessi OXPHOS. Non furu truvati canciamenti significativi ntà li livelli dî proteini coinvolti ntà l'apoptosi (Figura S2B). Â stissa manera, attruvaumu ca li mitucondri e li canali dû riticulum enduplasmaticu coinvolti ntò trasportu dû calciu hannu sulu canciamenti minuri (Figura S2C). Sparti, la valutazziuni dî proteini ligati all'autofagia non attruvau canciamenti significativi, ca è coerenti cu l'induzziuni visibbili di l'autofagusomi ossirvati in vivo cu l'immunuistochimica e la micruscopia elettronica (Figura S3). Com'è gghiè, la disfunziuni prugrissiva di l'OXPHOS nté PN è accumpagnata di canciamenti mitucondriali ultrastrutturali chiari. Li gruppi mitucondriali si ponnu vìdiri ntà li corpi cellulari e l'arbuli dintrìtici dî PN Mfn2cKO di l'età di 5 e 8 simani e la struttura dâ mimbrana nterna subìu canciamenti prufunni (Figura S4, A e B). Coerenti cu sti canciamenti ultrastrutturali e na diminuzziuni significativa ntò mtDNA, l'analisi dî feḍḍi ciriveḋḋi acuti cu l'estiri mitilicu di tetrametilrudamina (TMRM) mustrau ca lu putinziali dâ mimbrana mitucondriali ntà li PN Mfn2cKO fu assà diminuitu (Figura S4C).
(A) Analisi dû cursu dû tempu dû liveḍḍu d'esprissiuni dû cumplessu OXPHOS. Cunsidirari sulu li prutiini cu P<0,05 a 8 simani (ANOVA a dui vie). Linia punteggiata: nuḍḍa aggiustamentu rispettu a CTRL. (B) A manca: n'esempiu di na sizziuni ciriveḋḋa marcata cu l'anticorpu anti-MTCO1 (barra di scala, 20 μm). L'aria occupata dî corpi cellulari di Purkinje è cummigghiata di gialli. A dritta: quantificazziuni dî liveḍḍi di MTCO1 (analisi unidirezziunali dâ varianza; n = 7 nzinu a 20 celluli analizzati di tri surci). (C) Analisi qPCR dû nùmmaru di copi mtDNA ntô PN urdinatu (analisi unidirezziunali dâ varianza; n = 3 a 7 surci). (D) A manca: n'esempiu di na feḍḍa ciriveḋḋa marcata cu n'anticorpu anti-DNA (barra di scala, 20 μm). L'aria occupata dî corpi cellulari di Purkinje è cummigghiata di gialli. A dritta: quantificazziuni dî lizziuni mtDNA (analisi unidirezziunali dâ varianza; n = 5 nzinu a 9 celluli di tri surci). (E) N'esempiu di na sizziuni ciriveḋḋa acuta ca mustra li celluli mitoYFP + Purkinje (frèccia) ntà na riggistrazziuni di na pinza di patch a cellula intera. (F) Quantificazzioni dâ curba IV. (G) Riggistrazziuni rapprisintanti di l'iniezziuni di currenti dipularizzanti ntà li cèlluli di Purkinje CTRL e Mfn2cKO. Traccia supiriuri: lu primu pulsu ca attivau l'AP. Traccia di funnu: friquenza AP massima. (H) Quantificazziuni di l'input spuntànii postsinaptici (sPSP). La traccia di riggistrazzioni rapprisintanti e lu so rapportu di zoom su’ mustrati nna (I). L'analisi unidirezziunali dâ varianza analizzò n = 5 nzinu a 20 celluli di tri surci. Li dati sunnu espressi comu media±SEM; *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001. (J) Tracci rapprisintanti di AP spuntànii riggistrati usannu la modalità di pinza a patch pirfurata. Traccia supiriuri: friquenza AP massima. Traccia di funnu: zoom di nu sulu AP. (K) Quantificari la friquenza media e màssima AP sicunnu (J). test di Mann-Whitney; n = 5 cèlluli foru analizzati di quattru surci. Li dati sunnu espressi comu media±SEM; nun è mpurtanti.
Nu dannu ovviu a OXPHOS fu rilivatu ntà lu PN Mfn2cKO di 8 simani, ca innica ca la funziuni fisiuloggica dî neuruni è assà anormali. Pirciò, analizzamu li caratteristichi elèttrichi passivi dî neuruni cu dificienza di OXPHOS a 4 a 5 simani e a 7 a 8 simani eseguennu riggistrazziuni di pinza di patch interi cellulari ntà feḍḍi ciriveḋḋi acuti (Figura 2E). Inaspittatamenti, lu putinziali mediu dâ mimbrana di riposu e la risistenza all'input dî neuruni Mfn2cKO ìerunu simili ô cuntrollu, puru si c'èrunu diffirenzi suttili tra li celluli (tabbella 1). Â stissa manera, a 4 o 5 simani d’età, nun s’attruvàru canciamenti significativi nnâ rilazzioni currenti-tinzioni (curba IV) (Figura 2F). Com'è gghiè, nuḋḋu neuruni Mfn2cKO di 7 a 8 simani supravvivìu ô regimi IV (passu d'iperpularizzazziuni), ca innica ca c'è na chiara sinsibbilità ô putinziali d'iperpularizzazziuni ntà stu stadiu tardu. Ô cuntrariu, nté neuruni Mfn2cKO, li currenti dipularizzanti ca provocunu scaricamenti di putinziali d'azziuni ripititiva (AP) sunnu ben tullirati, ca innica ca li sò schemi di scaricamentu cumplissivi non sunnu significativamenti diversi di chiḋḋi dî neuruni di cuntrollu di 8 simani (tabbella 1 e figura 2G). Â stissa manera, la friquenza e l'ampizza dî currenti postsinaptichi spuntànii (sPSC) èrunu paragunabbili a chiḋḋi dû gruppu di cuntrollu e la friquenza di l'eventi aumintau di 4 simani a 5 simani a 7 simani a 8 simani cu n'aumentu simili (Figura 2, H e I). Lu piriudu di maturazziuni sinattica ntà li PN (25). Risultati sìmili foru uttinuti doppu li patch di PN pirfurati. Sta cunfigurazziuni evita lu pussibbili cumpensu dî difetti ATP cellulari, comu putissi succèdiri ntà riggistrazziuni dû patch clamp di tutti li celluli. In particulari, lu putinziali dâ mimbrana di riposu e la friquenza di sparatu spuntaniu dî neuruni Mfn2cKO non furu nfruenzati (Figura 2, J e K). ‘N riassuntu, chisti risultati ‘nnicanu ca li PN cu n’ovvia disfunziuni OXPHOS ponnu risòlviri beni li schemi ri scarica a àuta friquenza, ‘nnicannu ca c’è nu miccanìsimu ri cumpensazzioni ca ci cunzenti ri mantinèri risposti elettrofisiulòggici quasi nurmali.
Li dati sunnu espressi comu media ± SEM (analisi unidirezziunali dâ varianza, test ri cunfruntu mùrtiplu ri Holm-Sidak; *P<0,05). Lu nùmmaru di l'unità è nnicatu di parèntisi.
Accuminciamu a sturiari si qualchi catigurìa ntò dataset prutiomicu (Figura 1G) includi percorsi ca ponnu cummattiri na carenza grave di OXPHOS, spiegannu accussì picchì lu PN nfruenzatu pò mantèniri l'elettrofisioluggìa quasi nurmali (Figura 2, E a K). . L'analisi prutiomica mustrau ca l'enzimi coinvolti ntò catabbulismu di l'amminuacidi a catina ramificata (BCAA) ìerunu assà rigulati (Figura 3A e Figura S5A), e lu pruduttu finali acitil-CoA (CoA) o succinili CoA ponnu integrari li tricarbussilati ntà l'arteriusclerosi arterioidiTCA). Scuprìumu ca lu cuntinutu dâ transaminasi BCAA 1 (BCAT1) e BCAT2 aumintau sia. Catalizzaru lu primu passu dû catabbulismu BCAA ginirannu lu glutamatu di l'α-chituglutaratu (26). Tutti li suttanità ca cumponunu lu cumplessu di l'acidu diidroginasi a catina ramificata (BCKD) sunnu upregulati (lu cumplessu catalizza la dicarbussilazziuni succissiva e irrivirsibbili dû scheletru di carboniu BCAA ca risurta) (Figura 3A e Figura S5A). Com'è gghiè, non furu truvati canciamenti chiari ntà BCAA stissa ntà PN urdinata, ca pò essiri duvuta a l'aumentu di l'assorbimentu cellulari di st'amminuacidi essinziali o l'usu di autri funti (glucosiu o àcitu latticu) pi integrari lu ciclu TCA (Figura S5B). Li PN senza OXPHOS mustraru puru n'aumentu di dicumpusizziuni dâ glutamina e attività di trasminazziuni a 8 simani d'età, ca si pò riflèttiri dâ rigulazziuni supra l'enzimi mitucondriali glutaminasi (GLS) e glutamina piruvatu transaminasi 2 (GPT2) (Figura 3, A e C). Si va a nutari ca l'auturigulazziuni dû GLS è limitata â glutaminasi C isuforma spliciata (GLS-GAC) (lu canciamentu di Mfn2cKO/CTRL è circa 4,5 voti, P = 0,05), e la sò rigulazziuni spicifica ntà li tissuti biunergiundriali pò susteniri li mitucundriali. (27).
(A) La mappa dû caluri mustra lu canciamentu dâ piega ntô livellu dî prutiini pâ strata spicificata a 8 simani. (B) Esempiu di na feḍḍa ciriveḋḋa marcata cu l'anticorpu anti-PCx (barra di scala, 20 μm). La frèccia gialla punta ô corpu dâ cellula di Purkinje. (C) L'analisi di l'esprissiuni prutìica dû cursu dû tempu idintificata comu nu cannidatu mpurtanti pi l'aterusclerosi (test t multiplu, *FDR <5%; n = 3-5 surci). (D) Supra: nu schema ca mustra li diversi maneri di tràsiri ntô carboniu marcatu cuntinutu ntô tracciaturi piruvatu [1-13C] (azzoè attraversu lu PDH o la via trans-arteriali). Funnu: lu graficu dû violinu mustra la pircintuali di carboniu marcatu sulu (M1) cummirtutu ntà àcitu asparticu, àcitu cìtricu e àcitu màlicu doppu ca marcaru li feḍḍi ciriveḋḋi acuti cu [1-13C]piruvatu (test t accuppiatu; ** P <0,01). (E) Analisi cumpleta dâ storia dû tempu dû percorsu ‘ndicatu. Pigghiari ‘n cunsidirazzioni sulu li prutiìni cu P<0,05 a 8 simani. Linia trattijata: nuḍḍu valuri d’aggiustamentu (analisi a dui vie dâ varianza; * P <0,05; *** P <0,001). Li dati sunnu espressi comu media±SEM.
Ntà nostra analisi, lu catabbolismu BCAA addivintau una dî vie chiavi di rigulazziuni. Chistu fattu suggirisci fortimenti ca lu vulumi di vintilazzioni ca trasi ntô ciclu TCA pò canciari ntâ PN senza OXPHOS. Chistu pò rapprisintari na forma principali di ricablaggiu metabolicu niurunali, ca pò aviri n'impattu direttu ntà fisioluggìa niurunali e la supravvivenza duranti lu mantinimentu di na disfunziuni OXPHOS grave. Coerenti cu st'ipotisi, attruvaumu ca l'enzima anti-ateruscleroticu principali PCx è supra-rigulatu (Mfn2cKO/CTRL cancia circa 1,5 voti; Figura 3A), ca catalizza la cunvirsiuni dû piruvatu ntà ossaluacitatu (28), ca si cridi ca è ntà l'esprissiuni dû tissutu ntà l'a2. 30). Coerenti cchî risultati dâ prutiomica, la micruscopia cunfucali mustrò ca l'esprissiuni PCx fu spicificamenti e significativamenti aumintata nté PN cu dificienza di OXPHOS, mentri la riattività PCx fu principalmenti ristritta ê celluli gliali di Bergmann adiacenti dû cuntrollu (Figura 3B). Pi pruvari funziunalmenti l'upregulazziuni ossirvata dû PCx, trattamu li feḍḍi ciriveḋḋi acuti cû tracciaturi di piruvatu [1-13C]. Quannu lu piruvatu fu ossidatu dâ piruvatu diidroginasi (PDH), la sò etichetta isòtupa scumparìu, ma è incorpuratu ntà l'intermedi dû ciclu TCA quannu lu piruvatu è metabbulizzatu dî riazziuni vasculari (Figura 3D). Pi supportari li nostri dati prutiòmici, ossirvamu nu nummuru ranni di marcaturi di stu tracciaturi ntà l'àcitu asparticu di feḍḍi Mfn2cKO, mentri l'àcitu cìtricu e l'àcitu màlicu avìunu puru na tinnenza muderata, puru si nun significativa (Figura 3D).
Ntà li neuruni dopaminici dî surci MitoPark cu disfunziuni mitucondriali causata dî neuruni dopaminichi ca distruggunu spicificamenti lu geni dû fatturi di trascrizziuni mitucondriali A (Tfam) (Figura S6B), l'esprissiuni PCx fu puru assà rigulata (31), innicannu ca la disfunziuni di l'arteriusclerosi di l'acitunu acidu è la disfunziuni di l'arteriusclerosi. OSFO ntô corpu. Si va a nutari ca si scoprìu ca l'enzimi unichi (32-34) ca ponnu essiri esprissi nté neuruni ca ponnu essiri assuciati all'arteriusclerosi sunnu assà rigulati nté PN ca nun hannu OXPHOS, comu la carbussilasi prupiunil-CoA (PCC-A), la prupiunili-CoA carbussilasi (PCC-A), lu malunili-coA succiunina-CoA cummirtunu ntà prupiunili-coA. l'enzima 3 (ME3), ca avi lu rolu principali di ricupirari lu piruvatu dû malatu (Figura 3, A e C) (33, 35). Sparti, attruvamu n'aumentu significativu ntà l'enzima Pdk3, ca fosfurila e quinni inattiva lu PDH (36), mentri non furu rilivati ​​canciamenti ntà l'enzima Pdp1 ca attiva lu PDH o lu cumplessu enzimaticu PDH stissu (Figura 3A). Custantimenti, nté PN Mern2cKO, la fosfurilazziuni dâ sutunità α1 α (PDHE1α) dû cumpunenti dâ piruvatu diidroginasi E1 dû cumplessu PDH ntà Ser293 (canusciutu pi inibbiri l'attività enzimatica dû PDH) fu migghiurata (Figura S6C) (Figura S6C). Lu piruvatu non avi accessu vasculari.
 fini, attruvamu câ super via dâ biusintisi dâ sirina e dâ glicina, lu ciclu currilatu dû folatu mitucondriali (1C) e la biusintisi dâ prulina (Figura 1G e Figura S5C) sunnu tutti assà rigulati, secunnu li riporti, duranti lu prucessu d'attivazziuni. Li tissuti circustanti sunnu attivati ​​câ disfunziuni mitucondriali (5-7). L'analisi cunfucali ca supporta sti dati prutiomici mustrau ca ntà PN cu OXPHOS mancanti, li feḍḍi ciriveḋḋi di surci di 8 simani furu suggetti â serina idrossimetiltransfirasi 2 (SHMT2), n'enzima chiavi dû ciclu dû folatu mitucondriali. Risposta immunitaria significativa (Figura S5D). Ntà 13 feḍḍi ciriveḋḋi acuti incubati cu CU-glucosiu, li spirimenti di tracciamentu metabolicu cunfirmaru ultiriurmenti l'auturigulazziuni dâ biusintisi dâ sirina e dâ prulina, innicannu ca lu flussu di l'isoformi di carboniu ntà sirina e prulina aumintau (Figura S5E). Siccomu li riazziuni prumuvuti di GLS e GPT2 sunnu rispunsabbili dâ sintisi dû glutamatu dâ glutamina e dâ trasminazziuni tra glutamatu e α-chituglutaratu, la sò upregulazziuni innica ca li neuruni cu dificienza di OXPHOS hannu na dumanna aumintata di glutamatu, chistu pò essiri miratu a mantèniri la biusintisi aumintata dâ prourilina (Figg.5). Ô cuntrariu di sti canciamenti, n'analisi prutiomica di l'astruciti ciriveḋḋi dî surci Mfn2cKO spicifici dû PN mustràu ca sti percorsi (inclusi tutti l'antipirossidasi) non canciaru significativamenti ntà l'esprissiuni, dimustrannu quinni ca chista ridirizziuni metabolica è silittiva ô PN digradatu a D (Figg. S6, G6).
Comu riassuntu, st'analisi rivilaru schemi assà diversi d'attivazziuni timpurali di spicifici vie metabolichi ntà li PN. Puru si la funziuni mitucondriali neurunali anormali pò purtari a l'aterusclerosi pricoci e lu rimudellu 1C (Figura 3E e Figura S5C), e puru canciamenti pridicìbbili ntà l'esprissiuni dî cumplessi I e IV, li canciamenti ntà sintisi dâ serina de novo sunnu sulu ca addivintaru evidenti sulu ntà fasi tardiva. Disfunziuni OXPHOS (Figura 3E e Figura S5C). Sti risultati difinisciunu nu prucessu siquinziali aunni li mitucondriali indutti dô stress (ciclu 1C) e cituplasmatici (biusintisi dâ sirina) rispunnunu sinergisticamenti cu l'aumentu di l'aterusclerosi ntò ciclu TCA pi rimudellari lu metabbulismu niurunali.
Li PN cu dificienza di OXPHOS di 8 simani ponnu mantèniri n'attività d'eccitazziuni a auta friquenza e subbiri na ricunnissiuni metabolica significativa pi cumpensari la disfunziuni mitucondriali. Sta scuperta sulliva na pussibbilità ntirissanti ca puru ntà stu mumentu, sti celluli ponnu puru riciviri n'interventu terapeuticu pi ritardari o priviniri la neurudiginirazziuni. Tardu. Risolvìamu chista possibbilità ‘ntraversu dui ‘ntirventi ‘nnipinnenti. Ntô primu mètudu, pruggittamu nu vitturi dû vìrussu adeno-assuciatu (AAV) dipinnenti di Cre accussì ca MFN2 pò èssiri espressu silittivamenti ntê PN ca nun hannu OXPHOS in vivo (Figura S7A). L'AAV ca cudifica MFN2 e lu geni ripurtaturi fluoriscenti mCherry (Mfn2-AAV) furu virìficati nté culturi di niuruni primari in vitro, ca fici esprimiri lu MFN2 ntà na manera dipinnenti di Cre e sarbau la morfuluggìa mitucondriali, privinennu accussì la neurumutazziuni ntà MfnKO, B Figura S7). Appoi, cunnuciemu spirimenti in vivo pi cunsignari steriutàtticamenti Mfn2-AAV di 8 simani â curteccia ciriveḋḋa di Mfn2cKO e surci di cuntrollu, e analizzamu surci di 12 simani (Figura 4A). Li surci Mfn2cKO trattati muriru (Figura 1, A e B) (16). La trasduzziuni virali in vivo purtau a l'esprissiuni silittiva di PN ntà quarchi circu ciriveḋḋu (Figura S7, G e H). L'iniezziuni di l'AAV di cuntrollu ca esprimi sulu mCherry (Ctrl-AAV) nun appi n'effettu significativu ncapu lu gradu di neurudiginirazziuni ntà l'armali Mfn2cKO. Ô cuntrariu, l'analisi dî Mfn2cKO trasdutti cu Mfn2-AAV mustrò n'effettu prutittivu mpurtanti dû stratu cellulari PN (Figura 4, B e C). In particulari, la dinsità dî neuruni pari essiri quasi indistinguibbili di l'armali di cuntrollu (Figura 4, B e C e Figura S7, H e I). L'esprissiuni di MFN1 ma non di MFN2 è puru efficaci pi sarvari la morti niurunali (Figura 4C e Figura S7, C e F), ca innica ca l'esprissiuni di MFN1 ettopicu pò integrari efficacimenti la mancanza di MFN2. Ulteriori analisi a livellu singulu PN mustraru ca Mfn2-AAV salvau assà l'ultrastruttura dî mitucondri, nurmalizzau li livelli di mtDNA e invirtìu l'esprissiuni auta dû marcaturi anti-angiugginisi PCx (Figura 4, C nzinu a E). L'ispezziuni visiva dî surci Mfn2cKO salvati ntô statu di riposu mustrò ca la sò pustura e li sintomi muturi (muvimentu S1 a S3) foru migghiurati. Pi concludiri, sti spirimenti mustranu ca la riintroduzziuni ritardata di MFN2 nté PN assà dificienti ntà OXPHOS è bastanti pi invertiri lu cunsumu di mtDNA e innutari l'aterusclerosi, privinennu accussì la digginirazziuni di l'assoni e la morti niurunali in vivo.
(A) Nu schema ca mustra lu prugramma spirimintali pi iniettari AAV ca cudifica MFN2 quannu lu percorsu metabolicu innicatu è attivatu. (B) Fotugrafìi cunfucali rapprisintanti di sizziuni ciriveḋḋi di 12 simani trasdutti cu surci Mfn2cKO a 8 simani e marcati cu n'anticorpu anti-Calbindin. A dritta: scalatura dî fibbri di l'assoni. La scala dû zoom di l'assoni è di 450 e 75 μm. (C) A manca: quantificazziuni dâ dinsità cellulari di Purkinje ntò ciclu di trasduzziuni AAV (AAV+) (analisi unidirezziunali dâ varianza; n = 3 surci). A dritta: analisi dû focu mtDNA nnâ PN trasdutta â simana 12 (test t nun accuppiatu; n = 6 cèlluli di tri surci). * P <0,05; ** P <0,01. (D) Micrugrafi elettronici di trasmissiuni rapprisintanti di PN di sizziuni ciriveḋḋi Mfn2cKO trasdutti cchî vitturi virali innicati. La màscara rosa mustra l'aria occupata dî dindriti e lu quatratu gialli punteggiatu mustra lu zoom a manu dritta; n riprisenta lu nùcliu. Barra di scala, 1μm. (E) mustra n’esempiu di culurazzioni PCx nnâ PN trasdutta a 12 simani. Barra di scala, 20 μm. OE, suvraespressioni; FC, canciamentu di piega.
 fini, studiamu l'impurtanza dâ supravvivenza cellulari indutta dâ perossidasi nté PN ca spirimintaru na disfunziuni OXPHOS. Giniramu mCherry ca cudifica l’AAV-shRNA (RNA curtu) ca mirava ô spicìficu ô mRNA PCx dû surci (AAV-shPCx) e iniettamu lu vìrussu o lu so cuntrollu ammiscatu (AAV-scr) ntô ciriveḍḍu dî surci Mfn2cKO. L'iniezziuni fu fatta ntâ quarta simana d'età (Figura 5A) pi ottèniri nu knockdown efficaci dû PCx duranti lu pirìudu quannu l'esprissiuni dû PCx aumintau (Figura 3C) e lu stratu cellulari PN era ancora intattu (Figura 1A). Si va a nutari ca abbattiri lu PCx (Figura S8A) porta a n'accilirazziuni significativa dâ morti PN, ca è l'unicu aneḋḋu ristrittu d'infizziuni (Figura 5, B e C). Pi capiri lu miccanismu di l'effetti metabbolici indutti dâ rigulazziuni supra lu PCx, studiamu lu statu di riduzziuni dî PN doppu lu knockdown dû PCx e lu biusinsuri otticu mediatu di l'AAV Grx1-roGFP2 fu espressu simultaniamenti (Figura S8, B nzinu a D) pi valutari lu peptidi rilativi dû peptidi3. Poi, ficimu na micruscopia di mmàggini di vita a fluuriscenza a du' fotuna (FLIM) ntà feḍḍi ciriveḋḋi acuti di Mfn2cKO di 7 simani o cumpagni di nidu di cuntrollu pi rilevari canciamenti putinziali ntò statu di riduzziuni cituplasmaticu doppu la virìficazziuni dî cunnizziuni FLIM (Figura S8, E a G). L'analisi mustrò n'aumentu significativu ntò statu d'ossidazziuni di nu singulu PN Mfn2cKO senza esprissiuni PCx, ca è diversu dî neuruni di cuntrollu o dî PN Mfn2cKO ca esprimunu sulu shRNA scrambled (Figura 5, D e E). Quannu l'esprissiuni PCx fu sutta-rigulata, la pircintuali di PN Mfn2cKO ca mustraru nu statu assà ossidatu aumintau di cchiù di tri voti (Figura 5E), innicannu ca l'up-rigulazziuni PCx mantinìu la capacità di riduzziuni dî neuruni digginirati.
(A) Nu schema ca mustra lu prugramma spirimintali pi iniettari AAV ca cudifica shPCx quannu lu percorsu metabolicu innicatu è attivatu. (B) Fotugrafìi cunfucali rapprisintanti di sizziuni ciriveḋḋi di 8 simani nté surci Mfn2cKO trasdutti e marcati cu l'anticorpu anti-calcineurina a 4 simani. Barra di scala, 450 μm. (C) Quantificazziuni dâ dinsità cellulari di Purkinje ntà li cicli trasdutti di AAV (analisi unidirezziunali dâ varianza; n = 3 a 4 surci). Li dati sunnu espressi comu media±SEM; ***P<0,001. (D) L'immàggini FLIM rapprisintanti mustra la durata media dâ vita di PN di 7 simani ca esprimi lu sinsuri riduzzioni-ossidu dû glutatiuni Grx1-roGFP2 ntê cunnizziuni spirimintali spicificati. Rapportu LUT (tabbella di ricerca): ntirbaḍḍu di tempu di supravvivenza ('n picusicunni). Barra di scala, 25 μm. (E) L'istogramma mustra la distribbuzziuni dî valuri dâ vita Grx1-roGFP2 di (D) (n=158 nzinu a 368 celluli ntà du surci ntà ogni cunnizziuni). Lu graficu a tortu supra ogni istogramma: mustra lu nummuru di celluli cu valuri di durata di vita assà cchiù longhi (russi, ossidati) o cchiù curti (blu, riduciuti), ca supiranu 1 SD dû valuri di durata media ntà CTRL-AAV-scr. (F) Lu mudellu prupostu mustra l'effettu prutittivu di l'upregulazziuni dû PCx niurunali.
Tuttu chistu, li dati ca dunamu ccà mustranu câ riesprissiuni di MFN2 pò salvari completamenti lu PN avanzatu cu na carenza grave di OXPHOS, n'impoverimentu gravi di mtDNA e na morfuluggìa estremamenti anormali simili a l'ista, dannu accussì nu prugressu cuntinuu puru ntà malatii avanzati. La neurudiginirazziuni duna provi rivirsibbili dû stadiu prima dâ morti cellulari. Stu gradu di flissibbilità metabolica è suttaliniatu ultiriurmenti di l'abbilità dî neuruni d'innutari l'aterusclerosi (nu ricablaggiu dû ciclu TCA), ca inibbisci l'esprissiuni PCx nté PN senza OXPHOS e migliora la morti cellulari, jocannu accussì nu rolu prutittivu (Figura 5F).
Ntà stu studiu, furnimu provi câ risposta dî PN â disfunziuni OXPHOS è di cummirgiri gradualmenti all'aterusclerosi dû ciclu TCA attraversu lu percorsu d'attivazziuni diffirinziali attivatu dî programmi metabbolici. Cunfirmamu l'analisi pruteomica cu tanti mètudi cumplimintari e rivilamu ca quannu sunnu sfidati di na disfunziuni mitucondriali grave, li neuruni hannu na forma d'elasticità metabolica prima scanusciuta. Cu nostra surprisa, l'interu prucessu di ricablaggiu non signa pi forza lu statu metabbolicu tirminali ca accumpagna la neurudiginirazziuni gradualmenti e irrivirsibbilmenti, ma li nostri dati suggirisciunu ca pò custituiri nu niuruni di mantinimentu puru ntà fasi prima dâ morti cellulari Miccanismu di cumpensazziuni funziunali. Chistu risultatu innica ca li neuruni hannu nu gradu cunsidirevuli di plasticità metabolica ntò corpu. Chistu fattu prova câ riintroduzziuni succissiva di MFN2 pò invertiri l'esprissiuni dî marcaturi metabbolici chiavi e priviniri la digginirazziuni dû PN. Ô cuntrariu, inibbisci l'aterusclerosi e accilira li nervi. trassissuali.
Unu dî risultati cchiù affascinanti dâ nostra ricerca è ca li PN senza OXPHOS ponnu canciari lu metabbulismu dû ciclu TCA rigulannu l'enzimi ca stimulanu spicificamenti l'arteriosclerosi. Lu riarrangiamentu metabolicu è na carattirìstica cumuni dî celluli tumorali, cirtuni dî quali s'affidanu â glutamina pi integrari l'intermedi dû ciclu TCA pi prudurri equivalenti ridutturi, ca spinciunu la catina rispiratoria e mantènunu la produzziuni di pricursuri dâ biusintisi lipidica e nucliutidica (39 , 40). Nu studiu ricenti mustrò ca nté tissuti piriferici ca spirimintunu disfunziuni OXPHOS, la ricunnissioni dû metabbulismu glutamina/glutamatu è puru na carattirìstica pruminenti (5, 41), aunni la dirizziuni di l'ingressu dâ glutamina ntò ciclu TCA dipenni dâ gravità dâ firita OXPHOS (41). ). Com'è gghiè, ci sunnu provi chiari di qualsiasi sumigghianza dâ plasticità metabolica neurunali ntò corpu e la sò pussibbili rilevanza ntò cuntestu dâ malatia. Ntà nu studiu in vitro ricenti, li neuruni curticali primari furu dimustrati pi mubbilitari li piscini di glutamatu pâ neurutrasmissiuni, prumuvennu accussì lu metabbulismu ossidativu e l'aterusclerosi ntà cunnizziuni di stress metabolicu (42). Si va a nutari ca sutta l'inibbizziuni farmaculoggica di l'enzima dû ciclu TCA succinatu diidroginasi, si cridi ca la carbussilazziuni dû piruvatu manteni la sintisi di l'ossaluacitatu nté neuruni granulari ciriveḋḋi curtivati ​​(34). Com'è gghiè, la rilevanza fisiuloggica di sti miccanismi pò tissutu ciriveḋḋu (unni si cridi ca l'aterusclerosi è principalmenti limitata a l'astruciti) avi ancora nu significatu fisiuloggicu mpurtanti (43). Ntà stu casu, li nostri dati mustranu ca li PN danneggiati di l'OXPHOS ntò corpu ponnu essiri canciati â digradazziuni dû BCAA e â carbussilazziuni dû piruvatu, ca sunnu li du funti principali di supplimentazziuni dî ntirmidi dâ piscina TCA. Puru si lu cuntribbutu putativu dû catabbulismu BCAA ô metabbulismu di l'energia niurunali fu prupostu, ortri ô rolu dû glutamatu e dû GABA pâ neurutrasmissiuni (44), non ci sunnu ancora provi di sti miccanismi in vivo. Pirciò, è facili spiculari ca li PN disfunziunali ponnu cumpensari automaticamenti lu cunsumu di intermedi TCA guidati dû prucessu d'assimilazziuni aumintannu l'aterusclerosi. In particulari, l'upregulazziuni dû PCx pò essiri nicissària pi mantèniri na dumanna aumintata d'acidu asparticu, ca fu dimustratu nté celluli prulifiranti cu disfunziuni mitucondriali (45). Com'è gghiè, la nostra analisi metabbolica non rivilàu nuḋḋu canciamentu significativu ntò livellu stazzionariu di l'acidu asparticu nté PN Mfn2cKO (Figura S6A), ca prisumibbirmenti rifletti l'utilizzu metabbolicu diffirenti di l'acidu asparticu tra li celluli prulifiranti e li neuruni post-mitutici. Puru si lu miccanismu esattu di l'upregulazziuni PCx nté neuruni disfunziunali in vivo arresta caratterizzatu, dimustramu ca sta risposta prematura avi nu rolu mpurtanti ntò mantinimentu dû statu di ridox dî neuruni, ca fu dimustratu nté spirimenti FLIM nté feḍḍi ciriveḋḋi. In particulari, privinniri li PN di rigulari lu PCx pò purtari a nu statu cchiù ossidatu e accilirari la morti cellulari. L'attivazziuni dâ digradazziuni BCAA e la carbussilazziuni dû piruvatu non sunnu maneri pi carattirizzari li tissuti piriferici dâ disfunziuni mitucondriali (7). Pirciò, pari ca sunnu na carattirìstica priuritaria dî neuruni cu dificienza di OXPHOS, puru si non l'unica carattirìstica, ca è mpurtanti pà neurudiginirazziuni. .
La malatia ciriveḋḋa è nu tipu eterogginu di malatia neurudiginiritiva ca di solitu si manifesta comu atassia e spissu danni li PN (46). Sta populazziuni di neuruni è particularmenti vulnerabbili â disfunziuni mitucondriali picchì la sò digginirazziuni silittiva nté surci è bastanti pi riprodurri assà dî sintomi muturi ca caratterizzunu l'atassia spinuciribbellari umana (16, 47, 48). Secunnu li riporti, nu modellu di surci transgènicu cu nu geni mutanti è assuciatu a l’atassia spinociribbellari umana e havi na disfunziuni mitocondriali (49, 50), suttaliniannu l’impurtanza di studiari li cunsiquenzi dâ carenza di OXPHOS ntâ PNPH. Pirciò, è particularmenti adattu pi isulari e studiari efficacimenti sta populazziuni di neuruni unica. Com'è gghiè, vistu ca li PN sunnu assà sinsibbili â prissiuni e sunnu responsabbili di na prupurziuni vascia di l'intera populazziuni di celluli ciriveḋḋi, pi tanti studi basati ntà l'omica, la siparazziuni silittiva di chisti comu celluli interi è ancora n'aspettu difficili. Puru si è quasi impossibbili ottèniri na mancanza assuluta di cuntaminazziuni di autri tipi di celluli (spicialmenti li tissuti adulti), cumminamu nu passaggiu di dissociazziuni efficaci cû FACS pi ottèniri nu nummuru sufficienti di neuruni validi pi l'analisi prutiòmica a valli, e aviri na cupirtura pruteica abbastanza auta di l'insiemi di prutiini cerxi e (51). Preservannu la viabbilità di celluli interi, lu metudu ca furnimu ccà ci pirmetti non sulu di cuntrullari li canciamenti ntà li vie metabolichi ntà li mitucondri, ma puru di cuntrullari li canciamenti ntà li sò controparti cituplasmatici, ca cumplimenta l'usu di l'arricchimentu dâ mimbrana mitucondriali spicifica pî tipi di tissuti mitucundriali spicifici pî tipi di tissuti mitucondriali. (52, 53). Lu mètudu ca discrìvimu nun è sulu currilatu ô studiu dî celluli di Purkinje, ma pò essiri applicatu facilmenti a quarsiasi tipu di cellula pi affruntari li canciamenti metabbolici ntà lu ciriveḋḋu malatu, inclusi autri mudelli di disfunziuni mitucondriali.
 fini, idintificamu na finestra terapeutica duranti stu prucessu di riarrangiamentu metabolicu ca pò invertiri completamenti li signa chiavi dû stress cellulari e priviniri la digginirazziuni neurunali. Pirciò, capiri l'implicazziuni funziunali dû ricabblaggiu discrivutu ccà pò dari nfurmazziuni funnamintali nté trattamenti pussibbili pi mantèniri la viabbilità niurunali duranti la disfunziuni mitucondriali. È nicissària na ricerca futura mirata a dissìdiri li canciamenti ntô metabbulismu energèticu ntà autri tipi di cèlluli ciriveḋḋi pi rivilari completamenti l'applicabbilità di stu principiu a autri malatii neurulòggichi.
Li surci MitoPark foru discritti prima (31). Li surci C57BL/6N cchî geni Mfn2 ca s’affaccianu loxP foru discritti prima (18) e ncruciati cchî surci L7-Cre (23). La prugenii eterozzigota duppia ca risurtava fu poi ncruciata cu surci omuzzigoti Mfn2loxP/Mfn2loxP pi ginirari li geni spicìfici di Purkinje pi Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). Ntà nu suttanzemi d'accuppiamentu, l'alleli SorStop-mitu-YFP Gt (ROSA26) fu introduttu attraversu autri ncruciamenti (20). Tutti li pruciduri pi l’armali foru fatti ‘n accordu cu li linii guida eurupei, nazziunali e istituzzionali e appruvati dâ LandesamtfürNatur di Umwelt e Verbraucherschutz, Renania dû Nord-Westfalia, Girmania. Lu travagghiu supra l’armali segui macari li guidi dâ Fidirazzioni Europea di l’Associazziuni di Scienzi di l’Armali di Labburatoriu.
Doppu l'anestetizzazziuni dâ dislocazziuni circivali dâ donna incinta, l'imbriuni dû surciu è isulatu (E13). La curteccia fu dissizziunata ntà suluzziuni di sali bilanciata di Hanks (HBSS) ntigrata cu 10 mM di Hepes e passata ntà lu mediu di l'aquila mudificata di Dulbecco ca cuntinìa papaina (20 U/ml) e cistiina (1 μg/ml). Ncubari lu tissutu ntô DMEM) e dissociàrilu câ diggistiuni nzimàtica. Ml) a 37°C pi 20 minuti, e poi friscatu meccanicamenti nta DMEM ntigratu cû 10% di sirumu bovinu fìtali. Li cèlluli foru siminati ncapu a fogghi di vitru rivestiti cu polilisina a na dinsità di 2x106 pi piattu di curtura di 6 cm o a na dinsità di 0,5x105 cèlluli/cm2 pi l'analisi di l'immaggini. Doppu 4 uri, lu mediu fu scanciatu cu nu mediu senza sirumu Neurobasali ca cuntinìa l'1% di supplimentu B27 e 0,5 mM di GlutaMax. Li neuruni poi foru mantinuti a 37°C e 5% di CO2 duranti tuttu lu spirimentu e alimintati na vota â simana. Pi purtari la ricumminazziuni in vitro, 3 μl (piattu di curtura a 24 pozzi) o 0,5 μl (placca a 24 pozzi) dû vitturi dû vìrussu AAV9 fu usatu pi trattari li neuruni lu sicunnu jornu in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgen, nùmmaru di catàlugu 105530-AAV9) e AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgen, nùmmaru di catàlugu 105545-AAV9).
Lu DNA cumplimintari Mfn1 e Mfn2 dû surciu (uttinutu dû plàsmidi Addgene #23212 e #23213, rispittivamenti) è signatu câ siquenza V5 (GKPIPNPLLGLDST) ntô termini C e è fusu cu mCherry ntô quatru attraversu la siquenza T2A. Grx1-roGFP2 è nu rigalu di Heidelberg TP Dick DFKZ. Sustitujennu la cassetta tdTomato usannu mètudi di clunazzioni cumminziunali, la cassetta fu suttaclunata nnâ spina dursali di pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (nùmmaru di rifirimentu di l'agghiuncitina 28306) pi ginirari pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFNGAV-V5, pAAV-CAG-FLEX-tdTomato. Vittura FLEX-mCirizza-T2A-MFN1-V5 e pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. Na stratiggìa sìmili fu usata pi ginirari lu vitturi di cuntrollu pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Pi ginirari lu custruttu AAV-shPCx, è nicissariu nu vitturi plàsmidicu AAV (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), ca cunteni la siquenza di DNA ca cudifica lu shRNA ca mira ô surci PCx (5′ 3′) Sutta lu cuntrollu dû prumuturi U6, mCherry veni usatu sutta lu cuntrollu dû prumuturi CMV. La pruduzzioni di vittura AAV ausiliari fu fatta sicunnu li istruzzioni dû prudutturi (Cell Biolabs). Pi cumpritari, usa nu plàsmidi di trasfirimentu ca purta mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) trasfizziuni transitura di cellula mFAV2-293. (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) o Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) ca cudifica lu geni, accussì comu la prutiina càpsida AAV1 e lu plàsmidi di l'imballaggiu dâ prutiina accessoria, usannu lu mètudu dû fusfatu di càrciu. Lu supranatanti dû vìrussu grezzu fu uttinutu cu cicli di ghiacciu-sciogghimentu ntô bagnu di ghiacciu/etanolu siccu e li cèlluli lisati ntâ salina tampunizzata cu fusfatu (PBS). Lu vitturi AAV fu purificatu cu n'ultracentrifugazzioni discontinua a gradienti di jodissanolu (24 uri a 32.000 rpm e 4°C) e cuncintratu usannu un filtru cintrifugu ultra-15 Amicon. Lu tìtulu dû ginoma di AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9 x 1013 copia dû ginoma (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1 x 1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1 x 1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX fu misuratu comu pricidentimenti (qPCR) -MFN1-V5 (1,9 x 1013 GC/ml) e AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9 x 1012 GC/ml).
Li neuruni primari furu raschiati ntà PBS friddu ghiacciatu 1x, pellettati e poi omugginizzati ntà 0,5% Triton X-100 / 0,5% disossicolatu di sodiu/tampuni di lisi PBS ca cunteni fosfatasi e inibbituri pruteasi (Roche). La quantificazziuni dî prutiini fu fatta usannu lu test di l'àcitu bicincuninicu (Thermo Fisher Scientific). Li proteini foru poi siparati cu l'elettruforesi a gel di poliacrilamida SDS e poi macchiati ncapu na mimbrana di fluoru di polivinilidenu (GE Healthcare). Blocca siti nun spicìfici e ncuba cu l'anticorpu primariu (vidi tabbella S1 pî dittagghi) ntô latti ô 5% ntô TBST (salina tamponata cu Tris cu Tween), li passaggi di lavaggiu e l'anticorpu sicunnariu ntô TBST Incubate. Ncubari cu l'anticorpu primariu duranti la notti a +4°C. Doppu lu lavaggiu, appricari l'anticorpu sicunnariu pi 2 uri a timpiratura ambienti. Successivamenti, ncubannu lu stissu blot cu n’anticorpu anti-β-attina, fu cunfirmatu lu stissu càrricu. Rilevamentu cummirtennu 'n chimiluminiscenza e migghiurannu la chimiluminiscenza (GE Healthcare).
Li neuruni prima siminati ntà li coperchi di vitru furu fissati cû 4% di parafurmaldeidi (PFA)/PBS ntò puntu di tempu spicificatu a timpiratura ambienti pi 10 minuti. Li fogghi di cupirtura vennu prima pirmiati cû 0,1% di Triton X-100/PBS pi 5 minuti a timpiratura ambienti, e poi ntô tampuni di bloccu [3% di albumina sirumàtica bovina (BSA)/PBS]. Lu sicunnu jornu, li fogghi di cupirtura foru lavati cu nu tampuni di bloccu e ncubati cu l'anticorpu sicunnariu coniugatu cû fluoruforu apprupriatu pi 2 uri a timpiratura ambienti; â fini, li campioni foru lavati accuratamenti ‘n PBS cû 4′,6-diamidino-2-finilindolu (DAPI) è cuntraculuratu e quinni fissatu nnâ vetrina dû micruscopiu cu Aqua-Poly/Mount.
Li surci (masculi e fimmini) foru anestetizzati cu n'iniezziuni intrapiritunali di chitamina (130 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) e somministrati suttacutaneamenti cu l'analgèsicu carprufenu (5 mg/kg) e misi nta nu strumentu stiriutàtticu (Kopd a). Espòniri lu craniu e usari nu trapanu dintali pi asciugari la parti dâ curteccia ciriveḋḋa ca currispunni a l'ossu mis (dâ lambda: cuda 1,8, latirali 1, currispunnenti ê lobuli IV e V). Usa n'agugghia di siringa curba pi criari cu cura nu pirtusu nicu ntô craniu pi evitari di rumpiri la vasculatura sutta. Poi lu capillari di vitru suttili veni nseritu lentamenti ntô micru-foru (di -1,3 a -1 ntô latu vintrali dâ dura materia), e 200 a 300 nl di AAV veni iniettatu ntô micru-inietturi (Narishige) cu siringhi manuali (Narishige tissure) a nu pirìudu di tempu vasciu a 10 finestra di minuti. Doppu l'infusiuni, mettiri lu capillari pi n'autri 10 minuti pi fari diffunniri completamenti lu vìrussu. Doppu ca li capillari sunnu ritirati, la peḋḋi è suturata cu cura pi ridurri ô minimu l'inflamazziuni dâ firita e pirmettiri a l'armali di ricupirari. L'armali foru trattati cu analgèsici (caspofen) pi tanti jorna doppu l'opirazzioni, duranti lu quali li sò cunnizziuni fìsichi furu attentamenti monitorati e poi foru eutanasiati ntô puntu di tempu dichiaratu. Tutti li pruciduri foru eseguiti ‘n cunfurmità cu li linee guida eurupei, nazziunali e istituzzionali e foru appruvati dâ LandesamtfürNatur di Umwelt e Verbraucherschutz, Renania dû Nord-Westfalia, Girmania.
L'armali furu anestetizzati cu chitamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg), e lu cori fu pirfusu cu 0,1 M PBS prima e poi cu 4% di PFA ntà PBS. Lu tissutu fu dissizziunatu e fissatu ntô 4% di PFA/PBS duranti la notti a 4°C. Nu cuteḍḍu vibranti (Leica Microsystems GmbH, Vienna, Austria) fu usatu pi priparari sizzioni saggitali (spissi 50 μm) dû ciriveḍḍu fissu ntô PBS. Salvu ca non fussi spicificatu diversamenti, la culurazzioni di sizzioni a galleggianti lìbbiri fu fatta comu discrittu supra (13) a timpiratura ambienti e ammiscannu. ‘N brevi, prima, li feḍḍi uttinuti foru pirmiabbilizzati cû 0,5% di Triton X-100/PBS pi 15 minuti a timpiratura ambienti; pi quarchi epìtupu (Pcx e Shmt2), ntô tampuni tris-EDTA a 80°C (PH 9) caudiari li feḍḍi pi 25 minuti ô postu di stu passaggiu. Appoi, li sizziuni foru ncubati cu l'anticorpu primariu (vidi tabbella S1) ntô tampuni di bloccu (3% BSA/PBS) a 4°C duranti la notti ammiscannu. Lu jornu doppu, li sizzioni foru lavati cu nu tampuni di bloccu e ncubati cu l'anticorpu sicunnariu coniugatu cû fluoruforu apprupriatu pi 2 uri a timpiratura ambienti; â fini, li sizzioni foru lavati accuratamenti ‘n PBS, cuntraculurati cu DAPI e poi fissati cu AquaPolymount supra na vetrina dû micruscopiu.
Pì ‘mmagginari u campioni venni usatu 'n micruscopiu cunfucali a scanziuni laser (TCS SP8-X o Fogghiu ri Luci Diggitali TCS, Microsistemi Leica) dutatu ri 'n laser a luci janca e 'n laser ultraviulettu a 405 diodi. Eccitannu lu fluoruforu e arricuogghiennu lu signali cû rilevaturi ibbridi (HyD), lu prugramma LAS-X fu usatu pi arricogghiri mmàggini ammucciati cunfurmi ô campiunamentu di Nyquist 'n modalità siquinziali: pi pannelli nun quantitativi, si tratta di signali assai dinàmici (pir esempiu, nne cèlluli sumatichi e dindriti di UFPN) mt Modalità BrightR). Si applica nu gating di 0,3 a 6 ns pi arriddùciri lu sfunnu.
Immagginazzioni ‘n tempu riali di cèlluli urdinati. Doppu l'urdinamentu ntô menzu Neurobasali-A ca cunteni l'1% di supplimentu B27 e 0,5 mM GlutaMax, li cèlluli foru siminati subbitu ncapu vetri rivestiti di poli-l-lisina (μ-Slide8 Puzzu, Ibidi, nùmmaru di catàlugu 80826), e poi mantènirilu a 1% di CO pi stabbilirisi. L’immaggini ‘n tempu riali foru fatti cû micruscopiu cunfucali a scanziuni laser Leica SP8 dutatu di un laser jancu, HyD, lenti uggittiva a ogghiu 63×[1,4 apirtura numèrica (NA)] e nu palcu di caudiamentu.
Lu surci fu anestetizzatu subbitu cu diossidu di carboniu e decapitatu, lu ciriveḍḍu fu subbitu livatu dû craniu e tagghiatu nta na sizzioni saggitali spissa di 200 μm (pû spirimentu di marcatura 13C) o spissa di 275 μm (pi du' spirimenti a fotuni) chini dî matiriali crece (VHr5am) siguenti. Scientific, Walldorf, Girmania) è chini di li siguenti sustanzi: 125 mM friddi comu ghiacciu, saturati di carboniu (95% O2 e 5% CO2) vasciu Ca2 + fluidu ciribbruspinali artificiali (ACSF) NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM bufferi di sodiu, 1,25 mM mM2 di sodiu, 1,25 mM di bufferi di sodiu, 1,25 mM di sodiu. glucosiu, 0,5 mM CaCl2 e 3,5 mM MgCl2 (prissioni osmòtica di 310 a 330 mmol). Trasfiriri li feḍḍi ciriveḍḍi uttinuti nna na càmira di pri-ncubazzioni ca cunteni Ca2 + ACSF cchiù auti (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampuni di fusfatu di sodiu, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucosiu di Ca2C mM, 12 mM d-glucosiu. MgCl2) mediu) pH 7,4 e 310 a 320 mmol).
Duranti lu prucessu di mmàggini, li feḍḍi foru spustati nnâ stanza di mmàggini didicata e lu spirimentu fu fattu sutta na perfusioni cuntinua di ACSF a na timpiratura custanti di 32° a 33°C. Pi mmàggini a feḍḍi fu usatu un micruscopiu a scanziuni laser multifotuna (TCS SP8 MP-OPO, Micrusistemi Leica) dutatu di na lenti uggittiva Leica 25x (NA 0,95, acqua), nu laser Ti: Zaffiru (Camaleon Vision II, Cuirenti). Mòdulu FLIM (PicuArp300, PicuQuantu).
FLIM di Grx1-roGFP2. Li canciamenti ntò statu di riduzziuni cituplasmaticu dî PN furu misurati cu FLIM a du fotuni ntà feḍḍi ciriveḋḋi saggitali, aunni lu biusinsuri Grx1-roGFP2 mirava li PN. Ntò stratu PN, lu campu d'acquisizziuni è silizziunatu di circa 50 a 80 μm sutta la supirfici dâ feḍḍa pi assicuràrisi ca c'è nu PN validu (azzoè la mancanza di struttura pirlinata o canciamenti morfulòggici niurunali longu li dindriti) e lu sinsuri roGFP2 positivu duppiu positivu e la cudificazziuni PCx-RNA di cuntrollu o shRNA mCiliegia). Arricuogghiri mmàggini a pila sìngula cu zoom diggitali 2x [lunghizza d’unna di eccitazzioni: 890 nm; 512 nm 512 pixel]. Rilevamentu: HyD nternu, gruppu di filtru di isutiucianatu di fluorisceina (FITC)] e na media di l’immaggini ntra 2 e 3 minuti su’ usati pi assicuràrisi ca si arricuogghiunu bastanti fotuna (1000 fotuna ‘n tutali) pi l’adattamentu dâ curba. La sinsibbilità dâ sunna Grx1-roGFP2 e la virìfica dî cunnizzioni FLIM foru fatti monitorannu lu valuri di durata di vita di roGFP2 quannu agghiuncennu H2O2 esugenu 10 mM â pirfusiuni ACSF (pi massimizzari l'ossidazzioni, purtannu a n'aumentu di durata di vita di riduzzioni, purtannu a na diminuzzioni dâ durata dâ vita) (Figura S8, D a G). Usa lu prugramma FLIMfit 5.1.1 pi analizzari li risurtati acquisiti, adattari la singula curba di dicadimentu espuninziali di l'intera mmàggini a l'IRF misurata (funzioni di risposta dû strumentu), e χ2 è circa 1. Pi carculari la durata di vita di na singula maschera, la maschera era manualmenti la durata di vita di ogni maschera nta nu nervu. usatu pâ quantificazzioni.
Analisi dû putinziali mitucondriali. Doppu ca la sizziuni acuta fu ncubata cu 100 nM TMRM junciutu direttamenti a l'ACSF pirfusu pi 30 minuti, li canciamenti putinziali mitucondriali dî PN furu misurati cu nu micruscopiu a du fotuni. L’immagginazzioni TMRM fu fatta eccitannu la sunna a 920 nm e usannu HyD nternu (isotiucianatu di tetramitilrudamina: 585/40 nm) pi arricogghiri li signali; usannu la stissa lunghizza d'unna di eccitazzioni ma usannu n'HD nternu diversu (FITC:525/50) pi mmàgginari mtYFP. Usa lu plug-in Carculaturi di mmàggini di ImageJ pi valutari lu putinziali mitucondriali a liveḍḍu di na cèllula sìngula. ‘N brevi, l'equazziuni plug-in: signali = min (mtYFP, TMRM) veni usata pi idintificari la riggiuni mitucundriali ca mustra lu signali TMRM ntô sumali di Purkinje nna l'immaggini cunfucali a pila sìngula dû canali currispunnenti. Poi l'aria dî pixel ntà maschera ca risurta veni quantificata e poi nurmalizzata ntà l'immaggini a pila singula di limiti currispunnenti dû canali mtYFP pi uttèniri la frazziuni mitucondriali ca mustra lu putinziali mitucondriali.
L'immaggini fu smuntata cû prugramma Huygens Pro (Immaggini di vulumi scientifica). Pi l'immaggini scansionati dê mattunelli, lu muntaggiu di na sula mattunella veni fattu usannu l'arguritmu di cucitura autumàticu furnitu dô prugramma LAS-X. Doppu la calibrazzioni di l’immaggini, usa ImageJ e Adobe Photoshop pi prucissari ultiriurmenti l’immaggini e ajustari ‘n manera unifurmi lu lustru e lu cuntrastu. Usa Adobe Illustrator pâ priparazzioni gràfica.
Analisi dû focu dû mtDNA. Lu nummuru di lizziuni mtDNA fu quantificatu nté sizziuni ciriveḋḋi marcati cu anticorpi contra lu DNA cû micruscopiu cunfucali. Ogni aria birsagghiu fu criata pû corpu dâ cèllula e lu nucliu di ogni cèllula, e l'aria rispittiva fu calculata usannu lu plug-in Multi Measure (software ImageJ). Livari l'aria nucliari di l'aria dû corpu dâ cellula p'aviri l'aria cituplasmatica. Â fini, lu plug-in Analyze Particles (software ImageJ) fu usatu pi quantificari automaticamenti li punti dû DNA cituplasmaticu ca ìnnicanu lu mtDNA nnâ mmàggini di limiti e li risultati uttinuti foru nurmalizzati â media PN dî surci CTRL. Li risultati sunnu espressi comu lu nummuru mediu di nucliosidi pi cellula.
Analisi di l'esprissiuni prutìica. Usa lu plug-in Carculaturi di mmàggini di ImageJ pi valutari l'esprissiuni prutìica nnâ PN a liveḍḍu di na cèllula sìngula. In brevi, ntà l'immaggini cunfucali a nu stratu sulu dû canali currispunnenti, attraversu l'equazziuni: signali = min (mtYFP, anticorpu), si identifica la riggiuni mitucondriali ca mustra l'immunuriattività a nu certu anticorpu ntà Purkina. Poi l'aria dî pixel nnâ maschera ca risurta veni quantificata e poi nurmalizzata nnâ currispunnenti mmàggini a pila sìngula dû canali mtYFP p'aviri la frazzioni mitucondriali dâ prutiina mustrata.
Analisi dâ dinsità cillulari di Purkinje. Lu plug-in dû cuntaturi di cèlluli di ImageJ fu usatu pi valutari la dinsità di Purkinje dividennu lu nummuru di cèlluli di Purkinje cuntati pâ lunghizza di l'aneḍḍu ciriveḋḋu occupatu dî cèlluli cuntati.
Priparazzioni e ricota dû campioni. Lu ciriveḍḍu dû gruppu di cuntrollu e li surci Mfn2cKO furu fissati ntô 2% di PFA/2,5% di glutaraldeidi ntô tampuni fusfatu 0,1 M (PB), e poi li sizziuni curunali furu priparati usannu li ciliati (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) (Spissuri fissatu μm nzinu a PBn) tetraossidu e 1,5% di firrucianuru di putassiu a timpiratura ambienti pi 1 ura. Li sizzioni foru lavati tri voti cu acqua distillata e poi culurati cu l'etanolu ô 70% ca cuntinìa l'1% di acitatu d'uranilu pi 20 minuti. Li sizzioni foru poi disidratati nta l’arculu graduatu e ncorpurati nta risina epussìdica Durcupan ACM (risina di fusioni d’araldita M) (Scienzi dâ Micruscopia Elittronica, nùmmaru di catàlugu 14040) ntra vetri di vitru rivestiti di silicuni, e â fini a 60°C furmirizzati ntô furnu. L'aria dâ curteccia ciriveḍḍa fu scigghiuta e sizzioni ultrasuttili di 50 nm foru tagghiati ncapu a Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) e pigghiati ncapu a na griglia a fissura di ramu di 2×1 mm rivestita cu na pillìcula di polistirenu. Li sizzioni foru culurati cu na suluzzioni di 4% di acitatu di uranili nta H2O pi 10 minuti, lavati cu H2O assai voti, poi cu citratu di chiummu di Reynolds nta H2O pi 10 minuti, e poi lavati cu H2O assai voti. Li micrugrafìi foru pigghiati cû micruscopiu di trasmissiuni elettrònica Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) usannu na càmira diggitali TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, USA). Girmania).
Pi surci nfittati cu AAV, lu ciriveḍḍu fu siparatu e tagghiatu ntà na sizziuni saggitali spissa 1 mm e lu ciriveḋḋu fu esaminatu usannu nu micruscopiu a fluoriscenza pi identificari l'aneḍḍu nfittatu cu AAV (azzoè l'esprissiuni di mCherry). Sulu li spirimenti aunni l'iniezziuni AAV porta a n'efficienza di trasduzziuni assà auta dû stratu cellulari di Purkinje (cioè quasi tuttu lu stratu) ntà almenu du' aneḋḋi ciriveḋḋi cunzicutivi sunnu usati. Lu ciclu trasduttu di AAV fu micrudissizziunatu pi post-fissaggiu duranti la notti (4% PFA e 2,5% glutaraldeidi ntô tampuni di cacau 0,1 M) e ultiriurmenti prucissatu. Pi l'incorpurazzioni di l'EPON, lu tissutu fissu fu lavatu cu 0,1 M di tampuni di cacau di sodiu (Applichem) e ncubatu cu 2% di OsO4 (os, Sirvizzi Scientifici; Caco) nta 0,1 M di tampuni di cacau di sodiu (Applichem) 4 uri, poi lavatu pi 2 uri. Ripètiri 3 voti cu nu tampuni di cocamida 0,1 M. Successivamenti, la seri ascinnenti di etanolu fu usata pi ncubari ogni suluzzioni di etanolu a 4°C pi 15 minuti pi disidratari lu tissutu. Lu tissutu fu trasfirutu a l'ossidu di prupileni e ncubatu duranti la notti nna l'EPON (Sigma-Aldrich) a 4°C. Metti lu tissutu nta n’EPON friscu a timpiratura ambienti pi 2 uri, e poi ncorpuralu a 62°C pi 72 uri. Usa n’ultramicrutumu (Leica Microsystems, UC6) e un cuteḍḍu a diamanti (Diatome, Biel, Svìzzira) pi tagghiari sizzioni ultrasuttili di 70 nm, e culurari cu l’1,5% di acitatu di uranilu pi 15 minuti a 37°C, e culurari cu na suluzzioni di citratu di chiummu pi 4 minuti. Li micrugrafìi elittronici foru pigghiati usannu un micruscopiu elittronicu di trasmissiuni JEM-2100 Plus (JEOL) dutatu di nu prugramma Camera OneView 4K a 16 bit (Gatan) e nu prugramma DigitalMicrograph (Gatan). Pî l’anàlisi, li micrugrafìi elettrònici foru acquisiti cû zoom diggitali di 5000 o 10.000 x.
Analisi morfulòggica dî mitucondri. Pi tutti l'analisi, li isulini dî singuli mitucondri foru diliniati manualmenti nna mmàggini diggitali usannu lu prugramma ImageJ. Sunnu analizzati diversi paramitri morfulòggici. La dinsità mitucondriali è espressa comu na pircintuali uttinuta dividennu l'aria mitucondriali totali di ogni cellula pi l'aria dû cituplasma (aria dû cituplasma = aria dâ cellula-aria dû nucliu dâ cellula) × 100. La tunnizza dî mitucondri è calculata câ furmula [4π∙2(aria)]. La morfuluggìa ista dî mitucondri fu analizzata e divisa ntà du catigurìi ("tubbulari" e "vescica") a secunna dî sò formi principali.
Analisi dû nummuru di l'autofagusomi/lisosomi e dâ dinsità. Usa lu prugramma ImageJ pi diliniari manualmenti li isulini di ogni autufagusoma/lisosoma nna l'immaggini diggitali. L'aria di l'autofagusoma/lisosoma è espressa comu na pircintuali calculata dividennu l'aria totali dâ struttura di l'autofagusoma/lisosoma di ogni cellula pi l'aria dû cituplasma (aria dû cituplasma=aria dâ cellula-nucliu)×100. La dinsità di l'autofagusomi/lisosomi è calculata dividennu lu nummuru totali pò nummuru di strutturi autofagusomi/lisosomi pi cellula (in termini d'aria cituplasmatica) (aria cituplasmatica = aria cellulari-aria nucliari).
Etichettatura pâ sezzioni acuta e priparazzioni dû campioni. Pi spirimenti ca abbisognanu di marcatura dû glucosiu, trasfiriri li feḍḍi dû ciriveḍḍu acuti nna na càmira di pri-incubazziuni, ca cunteni carboniu saturatu (95% O2 e 5% CO2), Ca2 + ACSF jautu (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampuni di sodiu m3O, 1,25 mM fosfatu di sodiu. 25,0 mM di d-glucosiu, 1,0 mM di CaCl 2 e 2,0 mM di MgCl 2, ajustati a pH 7,4 e 310 a 320 mOsm), unni lu glucosiu è 13 C 6- sustituzzioni di glucosiu (Eurisotop, nùmmaru di catàlugu CLM6-1). Pi spirimenti ca richièdunu marcatura dû piruvatu, trasfiriri li feḍḍi ciriveḋḋi acuti a Ca2 + ACSF cchiù auti (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampuni di fusfatu di sodiu, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucosiu Ad2C mM, 100 mM d-glucosiu). MgCl2, aggiustari a pH 7,4 e 310 a 320 mOsm), e agghiùnciri 1 mM di piruvatu 1-[1-13C] (Eurisotop, nùmmaru di catàlugu CLM-1082). Ncubari li sizzioni pi 90 minuti a 37°C. Â fini dû spirimentu, li sizzioni foru lavati subbitu cu na suluzzioni acquea (pH 7,4) ca cuntinìa 75 mM di carbunatu d'ammòniu e poi omugginizati nta 40:40:20 (v:v:v) acitunitrilu (ACN): mitanolu: acqua. Doppu ca li sizzioni foru ‘ncubati supra u ghiacciu pì 30 minuti, li campioni foru centrifugati a 21.000 g pì 10 minuti a 4°C e u supranatanti chiaru fu asciugatu nnô cuncintraturi SpeedVac. Lu pellet di metabboliti siccu ca risurtau fu sarbatu a -80°C nzinu a l'analisi.
Analisi dâ spettrumitrìa di massa dâ cromatografìa liquida di 13 amminuacidi marcati cu C. Pi l'analisi dâ spettrumitrìa di massa dâ cromatografìa liquida (LC-MS), lu pellet di metabboliti fu risuspinnutu nta 75 μl d'acqua di qualità LC-MS (Honeywell). Doppu la centrifugazzioni a 21.000 g pi 5 minuti a 4°C, 20 μl dû supranatanti chiaritu foru usati pi l'analisi dû flussu di amminuacidi, mentri lu restu di l'estrattu fu usatu subbitu pi l'analisi aniònica (vidi sutta). L'analisi di l'amminuacidi fu fatta usannu lu protocollu di dirivatizzazzioni dû cloruru di binzoili discrittu prima (55, 56). Ntô primu passaggiu, 10 μl di carbunatu di sodiu 100 mM (Sigma-Aldrich) foru agghiunciuti a 20 μl di estrattu di metabboliti, e poi 10 μl di cloruru di binzoili ô 2% (Sigma-Aldrich) foru agghiunciuti a l'ACN di gradu LC. U campioni fu virtizzatu pì brevi e quinni centrifugatu a 21.000 g pì 5 minuti a 20°C. Trasfiriri lu supranatanti cancillatu nta na fiala di 2 ml di autocampionaturi cu n’insertu di vitru cònicu (200 μl di vulumi). Li campioni foru analizzati usannu lu sistema LC (Acqui) a rinnimentu ultra-àutu Acquity iClass culligatu ô spettròmitru di massa a pricisiuni a àuta risuluzzioni (Thermo Fisher Scientific). Pî l’analisi, 2 μl dû campioni dirivatu foru iniettati nnâ culonna ri sìlica T3 a àvuta risistenza ri 100 × 1,0 mm (Acqui) ca cuntinìa particeḍḍi ri 1,8 μm. Lu purtata è di 100 μl/min e lu sistema tampuni è furmatu di tampuni A (10 mM di furmatu d'ammuniu e 0,15% di àcitu fòrmicu nta l'acqua) e di tampuni B (ACN). Lu gradienti è lu siquenti: 0%B a 0 minuti; 0% B. 0 a 15% B a 0 a 0,1 minuti; 15 nzinu ô 17% B a 0,1 nzinu a 0,5 minuti; B ô 17 ô 55% ô 0,5 ô 14 minuti; B ô 55 ô 70% a 14 a 14,5 minuti; a 14,5 a 70 a 100% B a 18 minuti; 100% B a 18 a 19 minuti; 100 a 0% B a 19 a 19,1 minuti; 0% B ntra 19,1 e 28 minuti (55, 56). Lu spettrumètru di massa QE-HF òpira ‘n modalità di junizzazzioni pusitiva cu n’intervallu di massa di m/z (rapportu massa/càrrica) di 50 a 750. La risuluzzioni applicata è di 60.000, e lu birsagghiu di joni di cuntrollu di guadagnu (AGC) uttinutu è 3x106, e lu tempu di joni massimu è millico1. La funti di junizzazzioni a spruzzu caudiatu (ESI) òpira a na tinzioni di spruzzu di 3,5 kV, na timpiratura capillari di 250°C, nu flussu d'aria di guaina di 60 AU (unità arbitrari) e nu flussu d'aria ausiliari di 20 AU. 250°C. La lenti S è misa a 60 AU.
Analisi cromatografìa aniònica-MS di àciti urganici marcati 13C. Lu pricipitatu metabbolitu ristanti (55 μl) fu analizzatu usannu nu sistema di cromatugrafìa iònica Dionex (ICS 5000+, Termo Fisher scientificu) culligatu a nu spettròmitru di massa QE-HF (termu Fisher scientificu). ‘N brevi, 5 μl di estrattu di mitabboliti foru iniettati nna na culonna Dionex IonPac AS11-HC dutata di HPLC (2 mm × 250 mm, grannizza di particeḍḍi 4 μm, Thermo Fisher Scientific) ‘n modalità a ciclu parziali spinta cu na prupurzioni di riempimentu di 1.) on. Culonna di prutizzioni Dionex IonPac AG11-HC (2 mm x 50 mm, 4 μm, Termo Fisher Scientific). A timpiratura dâ culonna è mantinuta a 30°C e l’autocampionaturi è mpustatu a 6°C. Usa na cartuccia di idròssidu di putassiu cu acqua dijunizzata pi ginirari un gradienti di idròssidu di putassiu attraversu lu giniraturi di eluenti. Siparazziuni dî metabboliti a nu purtata di 380μl/min, applicannu lu gradienti siguenti: di 0 a 3 minuti, 10 mM KOH; 3 a 12 minuti, 10 a 50 mM KOH; 12 a 19 minuti, 50 a 100 mM KOH; 19 a 21 minuti , 100 mM KOH; 21 a 21,5 minuti, 100 a 10 mM KOH. La culonna fu riequilibbrata sutta 10 mM KOH pi 8,5 minuti.
Li metabboliti eluiti sunnu cumminati cu nu flussu di supplimentu di isuprupanolu di 150 μl/min doppu la culonna e poi diriggiuti a nu spettrumetru di massa a risuluzziuni auta ca opira ntà modalità di junizzazziuni nigativa. MS sta cuntrullannu l’intervallu di massa di m/z 50 a 750 cu na risuluzzioni di 60.000. L’AGC è misa a 1x106, e lu tempu massimu dî joni è tinutu a 100 ms. La funti ESI riscaldata fu azzionata a na tinzioni di spruzzu di 3,5 kV. L'autri paràmitri dâ funti di joni sunnu li siguenti: timpiratura capillari 275°C; flussu di gas dâ guaina, 60 AU; flussu di gas ausiliari, 20 AU a 300°C, e l'impostazzioni dâ lenti S a 60 AU.
Analisi dî dati dî metabboliti marcati cu 13C. Usa lu prugramma TraceFinder (virsiuni 4.2, Termu Fisher Scientifica) pi l’anàlisi dî dati dû rapportu isòtupu. L'identità di ogni cumpostu fu virìficata di nu cumpostu di rifirimentu affidabbili e analizzata nnipinnentimenti. Pi fari l'analisi di l'arricchimentu di l'isòtupi, l'aria dû cromatogramma di joni estratti (XIC) di ogni isòtupu 13C (Mn) fu estratta di [M + H] +, unni n è lu nùmmaru di carboniu dû cumpostu birsagghiu, usatu pi analizzari l'amminuacidi o [ MH] + è usatu pi analizzari l'aniuna. L’accuratizza dâ massa di XIC è cchiù picca di cincu parti ô miliuni, e l’accuratizza di RT è di 0,05 minuti. L'analisi d'arricchimentu si fa carculannu la prupurzioni di ogni isòtupu rilivatu câ summa di tutti l'isòtupi dû cumpostu currispunnenti. Sti prupurzioni su’ dati comu valura pircintuali pi ogni isòtupu, e li risurtati su’ espressi comu arricchimentu pircintuali mulari (MPE), comu discrittu prima (42).
Lu pellet di niuruni cugghiuti fu omugginizzatu ntà mitanolu friddu comu ghiacciu a l'80% (v/v), virtizzatu e ncubatu a -20°C pi 30 minuti. Vurtìciri arrè u campioni e arriminari a +4°C pì 30 minuti. U campioni fu centrifugatu a 21.000 g pì 5 minuti a 4°C e quinni u supranatanti ca risurta fu arricugghiutu e asciuttu usannu nu cuncintraturi SpeedVac a 25°C pì l’analisi succissiva. Comu discrittu supra, l'analisi LC-MS fu fatta ncapu l'amminuacidi dî celluli urdinati. Usannu TraceFinder (virsiuni 4.2, Thermo Fisher Scientific), l'anàlisi dî dati fu fatta usannu la massa monuisòtopica di ogni cumpostu. La nurmalizzazziuni quantili dî dati metabboliti fu fatta usannu lu pacchettu software preprocessCore (57).
Priparazzioni dâ fetta. Lu surci fu anestetizzatu subbitu cu diossidu di carboniu e decapitatu, lu ciriveḍḍu fu subbitu livatu dû craniu e lu cuteḍḍu virbanti chinu di ghiacciu (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Girmania) fu usatu pi tagghiàrilu nta 300% nzinu a 375 μm di gas di carboniu. CO2) Ca2 + ACSF vasciu (125,0 mM di NaCl, 2,5 mM di KCl, 1,25 mM di tampuni fusfatu di sodiu, 25,0 mM di NaHCO3, 25,0 mM di d-glucosiu, 1,0 mM di CaCl2 e 6,0 mM di Mg31 a pH372. mOsmu). Trasfiriri li feḍḍi ciriveḋḋi uttinuti nna na càmira ca cunteni Ca2 + ACSF cchiù jautu (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampuni di fusfatu di sodiu, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucosiu d-glucosiu, 4,0 mM Ca52 mM. e di 310 a 320 mOSm). Sarbari li feḍḍi pi 20 o 30 minuti accussì ponnu èssiri ristaurati prima di riggistrari.
rigistrazzioni. Pi tutti li riggistrazzioni fu usatu nu palcu di micruscopiu dutatu di na càmira di riggistrazzioni fissa e di na lenti uggittiva a immersioni nta l’acqua 20 voti (Scientifica). Li celluli putativi di Purkinje furu identificati di (i) la diminsiuni dû corpu, (ii) la pusizziuni anatomica dû ciriveḋḋu e (iii) l'esprissiuni dû geni ripurtaturi mtYFP fluoriscenti. La pipetta a patch cu na risistenza a punta di 5 a 11 megohm veni tirata fora di nu capillari di vitru di burusilicatu (GB150-10, 0,86 mm × 1,5 mm × 100 mm, prudutti scientifichi, Hofheim, Girmania) e di na pipetta urizzuntali Strumenti (P-1000). Tutti li riggistrazzioni foru fatti di n'amplificaturi a pinza npi ELC-03XS (GmbH elèttronica npi, Tam, Girmania), ca era cuntrullatu dû prugramma Signal (virsiuni 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, Regnu Unitu). Lu spirimentu fu registratu a 'na frequenza ri campionamentu ri 12,5 kHz. Lu signali veni filtratu cu du’ filtra Bessel a passaggiu curtu cu friquenzi di tagghiu rispittivamenti di 1,3 e 10 kHz. La capacità dâ mimbrana e dâ pipetta è cumpinzata dû circùitu di cumpensazzioni usannu l'amplificaturi. Tutti li spirimenti foru eseguiti sutta lu cuntrollu di na fotocamera Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Girmania), ca era cuntrullata dô software Hokawo (virsioni 2.8, Hamamatsu, Gerden, Girmania).
Cunfigurazzioni e analisi di routine di tutti li cèlluli. Subbitu prima dâ riggistrazzioni, allinchiri la pipetta câ suluzzioni nterna ca cunteni li sustanzi siguenti: 4,0 mM KCl, 2,0 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, 135,0 mM glucunatu di putassiu, 10,0 mM Hepes, 4,0 mM trifanoTPGsina (4,0 mM ATP.TPG) (Na) e 10,0 mM fusfatu di criatinina furu ajustati a nu pH 7,25 e la prissioni osmòtica era di 290 mOsm (saccarosiu). Subbitu doppu applicari na forza di 0 pA pi rumpiri la mimbrana, fu misuratu lu putinziali dâ mimbrana di riposu. La risistenza di nput veni misurata applicannu currenti iperpularizzati di -40, -30, -20 e -10 pA. Misura la grannizza dâ risposta dû vurtaggiu e usa la liggi di Ohm pi carculari la risistenza di nput. L'attività spuntània fu riggistrata nna na pinza di vurtaggiu pi 5 minuti e lu sPSC fu idintificatu e misuratu nna Igor Pro (virsiuni 32 7.01, WaveMetrics, Lagu Oswego, Oregon, USA) usannu nu script di ricanuscimentu semiautumàticu. La curba IV e la currenti a statu stazzionariu vennu misurati strincennu la battirìa a putinziali diversi (accuminciannu di -110 mV) e aumintannu lu vurtaggiu a passaggi di 5 mV. La pruduzzioni di AP fu tistata applicannu na currenti dipularizzanti. Fissari la cèllula a -70 mV applicannu n’impulsu di currenti dipularizzanti. Aggiustari la grannizza dû passaggiu di ogni unità di riggistrazzioni siparatamenti (di 10 a 60 pA). Carculari la friquenza AP massima cuntannu manualmenti li picchi di pulsi ca càusanu la friquenza AP cchiù auta. Lu lìmiti AP veni analizzatu usannu lu sicunnu dirivatu dû pulsu di dipularizzazzioni ca prima attiva unu o cchiù AP.
Cunfigurazzioni e anàlisi dî patch pirfurati. Eseguiri na riggistrazzioni di patch pirfurati usannu prutucoli standard. Usa na pipetta senza ATP e GTP ca nun cunteni li ngridienti siguenti: 128 mM di glucunatu K, 10 mM di KCl, 10 mM di Hepes, 0,1 mM di EGTA e 2 mM di MgCl2 e aggiustari a pH 7,2 (usannu KOH). L'ATP e lu GTP sunnu omissi dâ suluzziuni intracellulari pi evitari la pirmiabbilità non cuntrullata dâ mimbrana cellulari. La pipetta dû patch è chini di na suluzzioni nterna ca cunteni anfutiricina (circa 200-250 μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) pi uttèniri na riggistrazzioni dû patch pirfuratu. L'anfutiricina fu dissolta nnô surfussidu di dimitili (cuncintrazzioni finali: 0,1 nzinu a 0,3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). La cuncintrazziuni di DMSO usata non appi n'effettu significativu ntà li neuruni studiati. Duranti lu prucessu di punzatura, la risistenza dû canali (Ra) fu cuntrullata cuntinuamenti e lu spirimentu accuminciò doppu ca l'ampizza di Ra e AP si stabbilizzaru (20-40 minuti). L'attività spuntània veni misurata ntâ na pinza di vurtaggiu e/o currenti pi 2-5 minuti. L'anàlisi dî dati fu fatta usannu Igor Pro (virsiuni 7.05.2, WaveMetrics, USA), Excel (virsiuni 2010, Microsoft Corporation, Redmond, USA) e GraphPad Prism (virsiuni 8.1.2, GraphPad Software Inc. Stati Uniti). Pî idintificari li AP spuntànii, si usa lu plug-in NeuroMatic v3.0c di IgorPro. Identificari ‘n manera autumàtica li AP usannu nu certu lìmiti, ca veni arriggistratu ‘n manera ‘nnividuali pì ogni registrazzioni. Usannu lu ntirbaḍḍu di punta, ditirminari la friquenza di punta câ friquenza massima di punta istantanea e la friquenza media di punta.
Isulamentu PN. Adattannusi ô protocollu pubblicatu prima, li PN foru purificati dû ciriveḍḍu dû surci a nu certu stadiu (58). In brevi, lu ciriveḋḋu fu dissizziunatu e tritatu ntà nu menzu di dissociazziuni friddu comu ghiacciu [senza HBSS Ca2+ e Mg2+, ntigratu cu 20 mM di glucosiu, pinnicillina (50 U/ml) e strettumicina (0,05 mg/ml)], e poi diggirìtu lu menzu cu mgSSHB-1steinina [ / ml), papaina (16 U / ml) e disussirribbunucliasi I (DNasi I; 0,1 mg/ml)] Trattari pi 30 minuti a 30°C. Prima lavari li tissuti ntô menzu HBSS ca cunteni mucus ovu (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) e DNasi (0,1 mg/ml) a timpiratura ambienti pi priviniri la diggistiuni nzimàtica, e poi ntô menzu HBSS ca cunteni 20 mM di glucosiu, macinannu dilicatamenti ntâ HBmicina/HBlm5 (0,05 mg/ml) e la DNasi (0,1 mg/ml) rilassunu celluli sìnguli. La suspinsioni cillulari ca risurtau fu filtrata attraversu nu filtru cillulari di 70 μm, poi li cèlluli foru pillettati pi centrifugazzioni (1110 rpm, 5 minuti, 4°C) e risuspinnuti ntô menzu di urdinamentu [HBSS, ntigratu cu 20 mM di glucosiu, 20% strimicina fitali e strimicina bovina) Sirumu, (0,05 mg/ml)]; valutari la viabbilità cellulari cû joduru di prupidiu e ajustari la dinsità cellulari a 1×106 a 2×106 celluli/ml. Prima dâ citumetria a flussu, la suspinsioni fu filtrata attraversu nu filtru cillulari di 50 μm.
Citòmitru di flussu. La scelta di cèlluli fu fatta a 4°C usannu la màchina FACSAria III (Biuscienzi BD) e lu prugramma FACSDiva (Biuscienzi BD, virsiuni 8.0.1). La suspinsioni cellulari fu urdinata usannu n'ugghiu di 100 μm sutta na prissioni di 20 psi a na vilucità di ~2800 eventi/sec. Siccomu li criteri di gating tradizziunali (diminsiuni dâ cellula, discriminazziuni bimudali e caratteristichi di diffusioni) non ponnu assicurari l'isolamentu currettu dû PN di l'autri tipi di celluli, la stratiggìa di gating è fissata ntà basi dû cunfrontu direttu di l'intinsità YFP e l'autofluuriscenza ntà mitoYFP+ ​​e lu mitoYFP di cuntrollu. YFP veni eccitatu irraggiannu lu campioni cu na linia laser di 488 nm e lu signali veni rilivatu usannu nu filtru passaggiu a banda di 530/30 nm. Ntà li surci mitoYFP+, la forza rilativa dû geni ripurtaturi Rosa26-mitoYFP è usata puru pi distinguiri li frammenti dû corpu niurunali e di l'assoni. Lu 7-AAD è eccitatu cu un laser giallu di 561 nm e rilivatu cu un filtru passa-banda di 675/20 nm pi esclùdiri li cèlluli morti. Pî siparari l’astruciti ntô stissu tempu, la suspinsioni cillulari fu culurata cu ACSA-2-APC, poi lu campioni fu irraggiatu cu na linia laser di 640 nm e nu filtru passa-banda di 660/20 nm fu usatu pi rilevari lu signali.
Li cèlluli arricugghiuti foru pillettati pi centrifugazzioni (1110 rpm, 5 minuti, 4°C) e sarbati a -80°C nzinu a l'usu. Li surci Mfn2cKO e li sò cuccioli di nidu sunnu classificati ntô stissu jornu pi ridduciri ô minimu la variabbilità prucidurali. La prisintazzioni e l'anàlisi dî dati FACS foru eseguiti usannu lu prugramma FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA).
Comu dittu supra (59), lu PCR 'n tempu riali veni usatu pi isulari lu DNA dî neuruni urdinati pâ succissiva quantificazziuni dû mtDNA. La liniarità e la sinzibbilità dû limiti accuminciannu foru tistati facennu qPCR ncapu a nummari diversi di cèlluli. Pi cumpritari, arricuogghiri 300 PN nna nu tampuni di lisi fattu di 50 mM tris-HCl (pH 8,5), 1 mM EDTA, 0,5% Tween 20 e prutiinasi K (200 ng/ml) e ncubari a 55°C pi 120 minuti. Li cèlluli foru ncubati n'autra vota a 95°C pi 10 minuti pi assicurari l'inattivazziuni cumpleta dâ prutiinasi K. Usannu na sunna TaqMan (Thermo Fisher) spicìfica di mt-Nd1, lu mtDNA fu misuratu cu PCR semi-quantitativu nnô sistema PCR Scientisher 'n tempu riali 7900HT (Ther). Scienza, nùmmaru di catàlugu Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Termo Fisher Scientific, nùmmaru di catàlugu AIVI3E8) e 18S (Termo Fisher Scientific, nùmmaru di catàlugu Hs99999901_s1).
Priparazzioni dû campioni dû prutioma. Riscaldannu la suluzzioni a 95°C pi 10 minuti e sunicannu, nnô tampuni di lisi [6 M di cloruru di guanidina, 10 mM di cloruru di tris (2-carbussitili) fusfina, 10 mM di cloruacitamida e 100 mM di pellet di tris-HC lisi niuruni cugghiuti]. Supra lu Biurupturi (Diagginodu) pi 10 minuti (30 sicunni di pulsu / 30 sicunni di pirìudu di pausa). Lu campioni fu dilujatu 1:10 nta 20 mM tris-HCl (pH 8,0), ammiscatu cu 300 ng d'oru tripsina (Promega) e ncubatu duranti la notti a 37°C pi ottèniri na diggistiuni cumpleta. Lu secunnu jornu, u campioni fu centrifugatu a 20.000 g pì 20 minuti. Lu supranatanti fu dilujatu cu l'àcitu fòrmicu ô 0,1% e la suluzzioni fu disalata cu StageTips autufatti. Lu campioni fu asciugatu nnô strumentu SpeedVac (cuncintraturi Eppendorf cchiù 5305) a 45°C e quinni lu peptidi fu suspinnutu nnô 0,1% di àcitu fòrmicu. Tutti li campioni foru priparati simultaniamenti dâ stissa pirsòna. Pî analizzari li campioni di astruciti, 4 μg di peptidi disalati foru marcati cu n’etichetta di massa ‘n tandem (TMT10plex, nùmmaru di catàlugu 90110, Thermo Fisher Scientific) cu na prupurzioni di peptidi/riaggenti TMT di 1:20. Pi marcari TMT, 0,8 mg di riaggenti TMT foru risuspinnuti nta 70 μl di ACN anidru e lu peptidi siccu fu ricustituitu nta 9 μl di 0,1 M TEAB (bicarbunatu di trietilammoniu), a cui foru agghiunciuti 7 μl di riaggenti TMT nta ACN. La cuncintrazzioni era dû 43,75%. Doppu 60 minuti di ncubazzioni, la riazzioni fu stirata cu 2 μl di idrossilamina ô 5%. Li peptidi marcati foru arricugghiuti, asciugati, risuspinnuti nta 200 μl di àcitu furmicu (FA) ô 0,1%, spartuti nta dui e poi disalati usannu StageTips autufatti. Usannu lu cromatografu liquidu UltiMate 3000 a granni prissioni (crumatografu liquidu ultra auti prissioni UltiMate 3000), una dî du’ mità fu frazziunata nna na culonna cromatugrafica Acquity di 1 mm x 150 mm china di particeḍḍi di C18 di 130 Å1,7 μm (NoWaters, catalog150). Termo Fisher scientificu). Siparari li peptidi a nu purtata di 30 μl/min, siparari di l'1% ô 50% dû tampuni B pi 85 minuti cu nu gradienti graduali di 96 minuti, dû 50% ô 95% dû tampuni B pi 3 minuti, poi 8 minuti pû 95% dû tampuni B; Lu tampuni A è 5% ACN e 10 mM bicarbunatu d'ammuniu (ABC), e lu tampuni B è 80% ACN e 10 mM ABC. Arricuogghiri li frazziuna ogni 3 minuti e cumminàrili ‘n du’ gruppi (1 + 17, 2 + 18, ecc.) e asciugàrili ‘n centrifuga ô votu.
Analisi LC-MS/MS. Pi la spettrumitrìa di massa, li pèptidi (nùmmaru r119.aq) foru siparati nna na culonna analìtica PicoFrit di 25 cm e diamitru nternu 75 μm (nova lenti uggittiva, nùmmaru di parti PF7508250) dutata di 1,9 μm di mezzu ReproSil-Pur C12). EASY-nLC 1200 (Scientificu Termufisher, Girmania). La culonna fu mantinuta a 50°C. Li tampuni A e B su' rispittivamenti l'0,1% di àcitu furmicu nta l'acqua e lu 0,1% di àcitu furmicu nta l'80% di ACN. Li peptidi foru siparati cu nu gradienti graduali di 200 nl/min dû 6% ô 31% dû tampuni B pi 65 minuti e dû 31% ô 50% dû tampuni B pi 5 minuti. Li peptidi eluiti foru analizzati ncapu a nu spettrumètru di massa di fusiuni Orbitrap (Scientifica Termo Fisher). La misurazzioni dû pricursuri peptidicu m/z si fa cu na risuluzzioni di 120.000 ntra 350 e 1500 m/z. Usannu l'enirgìa di cullisiuni nurmalizzata dû 27%, lu pricursuri cchiù forti cu nu statu di càrrica di 2 a 6 veni scigghiutu pâ scissiuni dâ dissociazziuni dâ trappa C (HCD) a àuta enirgìa. Lu tempu dû ciclu è misa a 1 s. Lu valuri m/z dû frammentu peptidicu fu misuratu ntà trappa ionica usannu lu birsagghiu AGC cchiù nicu di 5x104 e lu tempu d'iniezziuni massimu di 86 ms. Doppu la frammentazziuni, lu pricursuri fu misu ntâ lista d'esclusioni dinàmica pi 45 s. Li peptidi marcati cu TMT foru siparati nna na culonna Acclaim PepMap di 50 cm e 75 μm (Thermo Fisher Scientific, nùmmaru di catàlugu 164942), e li spettri di migrazziuni foru analizzati nna nu spettrumetru di massa tribbridi di Orbitrap Lumos comu spettròmitru di massa tribbridi Orbitrap Lumos (FAIMS) (Thermo Fisher Scientific) òpira a du’ tinzioni di cumpensazzioni di -50 e -70 V. MS3 scigghiutu ncapu la basi dû pricursuri di sincrunizazzioni veni usatu pâ misurazzioni dû signali di joni dû rapportu TMT. La siparazzioni dî peptidi fu fatta ncapu EASY-nLC 1200, usannu n'eluzzioni a gradienti liniari dû 90%, cu na cuncintrazzioni di tampuni dû 6% nzinu ô 31%; lu tampuni A era dû 0,1% di FA e lu tampuni B era dû 0,1% di FA e dû 80% di ACN. La culonna analìtica veni azziunata a 50°C. Usa FreeStyle (virsiuni 1.6, Termu Fisher Scientific) pi spàrtiri lu file urigginali sicunnu lu vurtaggiu di cumpensazzioni FAIMS.
Idintificazziuni e quantificazziuni dî prutiini. Usannu lu muturi di ricerca ntigratu di Andròmida, li dati urigginali foru analizzati usannu la virsiuni 1.5.2.8 di MaxQuant. Ortri ê siquenzi dâ ricumminasi Cre e YFP uttinuti di Aequorea victoria, li spettri dî frammenti peptidici furu circati pâ siquenza canònica e la siquenza isuforma dû prutioma di rifirimentu dû surciu (ID dû prutioma UP000000589, scaricatu di UniProt a maggiu20). L'ossidazziuni dâ mitionina e l'acitilazziuni N-tirminali dâ pruteina furu fissati comu mudifichi variàbbili; La mitilazziuni dâ cistiina carbamoili fu misa comu modifichi fissi. Li paramitri di diggistiuni sunnu misa a "spicificità" e "tripsina/P". Lu nùmmaru mìnimu di peptidi e peptidi di rasolu usati pi identificari li prutiini è 1; lu nummuru minimu di peptidi unichi è 0. Ntê cunnizziuni di l'abbinamentu dâ mappa peptidica, lu tassu d'identificazziuni dî proteini era di 0,01. L'opzzioni "Sicunnu peptidi" è attiva. Usa l'upzzioni "abbinamentu ntra cursi" pi trasfiriri identificazzioni di successu ntra diversi file urigginali. Usa lu nùmmaru mìnimu dû rapportu LFQ 1 pâ quantificazzioni senza etichetta (LFQ) (60). L'intinsità LFQ è filtrata pi almìenu du valuri validi ntà almìenu nu gruppu di ginutipu a ogni puntu di tempu e è estrapulata di na distribbuzziuni nurmali cu na larghizza di. 0,3 e spustarisi versu sutta 1,8. Usa la chiattaforma di cumputazzioni Perseus (https.maxquant.net/perseus/) e R (https/pruggettu.org/) pi analizzari li risultati dû LFQ. Pi l'anàlisi di l'esprissiuni diffirinziali fu usatu nu test t mudiratu a dui vie dû pacchettu software limma (61). L'anàlisi dî dati esplurativi veni fatta usannu ggplot, FactoMineR, fattuestra, GGally e pheatmap. Li dati prutiòmici basati ncapu lu TMT foru analizzati usannu la virsiuni 1.6.10.43 di MaxQuant. Ricerca di dati prutiòmici grezzi dû databbasi di prutiòmica umana di UniProt, ca fu scaricatu a sittèmmiru 2018. L'analisi nchiudi lu fatturi di currizzioni di purità di l'isòtupi furnitu dû prudutturi. Usa limma nna R pi l'anàlisi di l'esprissiuni diffirinziali. Li dati urigginali, li risultati dâ ricerca dû databbasi e lu flussu di travagghiu e li risultati di l'anàlisi dî dati su' tutti sarbati nna l'allianza ProteomeXchange attraversu lu ripusitòriu dû cumpagnu PRIDE cu l'idintificaturi dû nzemi di dati PXD019690.
L'annutazzioni funziunali arricchisciunu l'anàlisi. Lu strumentu Analisi dû Percorsu di ‘ngignusità (QIAGEN) fu usatu pì additirminàri a ricchìzza dî termini ri annotazzioni funziunali dû nzemi ri dati a 8 simani (Figura 1). In brevi, la lista quantitativa dî prutiini uttinuta di l'analisi dî dati LC-MS/MS (spettrumitrìa di massa tandem) è usata cchî criteri di filtru siguenti: Mus musculus è silizziunatu comu speci e sfunnu e la catigurìa mustra lu valuri P ajustatu di Benjamini pi l'arricchimentu 0,05 o cchiù vasciu è cunsidiratu significativu. Pì chistu gràficu, sunnu mustrati li cincu catigurìi eccessivi principali nnî ogni cluster ‘n basi ô valuri P aggiustatu. Usannu cchiù test t, usannu lu prugramma di stimulu liniari a dui fasi di Benjamini, Krieger e Yekutieli (Q = 5%), l'analisi di l'esprissiuni prutìica ntô cursu dû tempu veni fatta ncapu li cannidati mpurtanti identificati nta ogni catigurìa e ogni riga veni analizzata siparatamenti. Nun è necessariu aduttari nu SD coerenti.
Pî cunfruntari li risultati di stu studiu cchî basi di dati pubbricati e ginirari nu diagramma di Venn ntâ Figura 1, cumminamu la lista quantitativa dî prutiini cu l'annutazziuni MitoCarta 2.0 (24). Usa lu strumentu online Disigna lu schema di Venn (biunfurmàtica.
Pi nfurmazzioni dittagghiati ncapu li pruciduri statìstichi usati pi l'analisi prutiòmica, si prega di cunsultari la sizzioni currispunnenti di Matiriali e Mètudi. Pì tutti l’avutri spirimenti, ‘nformazzioni dittagghiati ponnu èssiri attruvati nnâ liggenna currispunnenti. Salvu ca nun è spicificatu diversamenti, tutti li dati sunnu espressi comu media ± SEM e tutti li analisi statìstichi foru eseguiti usannu lu prugramma GraphPad Prism 8.1.2.
Pi matiriali supiriuri pi stu artìculu, si prega di vìdiri http://
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Di E. Motori, I. Atanassov, S. M. V. Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N. G. Larson
L'analisi prutiomica dî neuruni disfunziunali rivilàu ca li programmi metabbolici sunnu attivati ​​pi cummattiri la neurudiginirazziuni.
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©2020 Associazzioni ‘miricana pû prugressu dâ scienza. tutti li diritti riservati. AAAS è nu cumpagnu di HINARI, AGORA, OARE, CORO, CLOCKSS, CrossRef e CONTATOR. Avanzamenti dâ Scienza ISSN 2375-2548.