Diversi tiurii di difisa di chianti dannu guidi tiurichi mpurtanti pi schicari li schemi di mitabbulismu spicializzatu di chianti, ma li so privisioni chiavi arrestanu di pruvari. Cca, usamu l'analisi di spettrumitrìa di massa tandem (MS/MS) pi esplurari sistematicamenti lu mitabbulumu di ceppi attenuati di tabbaccu di chianti nnividuali a pupulazzioni e speci strittamenti currilati, e prucissamu un granni nummaru di tiurii di carattirìstichi spettrumetrichi di massa basati ncapu li spettri cumposti nne nfurmazzioni. Quadru pi virìficari li privisioni chiavi dî tiurìi dâ difisa ottimali (DO) e dû birsagghiu ‘n movimentu (MT). Lu cumpunenti nfurmativu dâ mitabbulomica di chianti è coerenti câ tiuria OD, ma cuntradici la privisioni principali dâ tiuria MT ncapu li dinàmichi mitabbulomichi causati di l'erbivori. Dâ scala evulutiva micru â macro, lu signali giasmunatu fu identificatu comu ditirminanti principali di l'OD, mentri lu signali di etileni furniu n'accordu finu dâ risposta spicifica di l'erbivori annotata dâ riti muliculari MS/MS.
Li mitabboliti spiciali cu strutturi diversi su' li participanti principali nna l'adattamentu di chianti a l'ammienti, supratuttu nnâ difisa di nimici (1). La diversificazzioni stupenti dû mitabbulismu spiciali ca si trova nne chianti stimulau dicenni di ricerchi prufunni ncapu li so tanti aspetti di funziuna eculoggichi, e furmau na lista longa di tiurii di difisa di chianti, ca su' lu sbiluppu evulutivu e eculoggicu di ntirazzioni chianti-nzetti. La ricerca empìrica duna na guida mpurtanti (2). Cumunca, sti tiurii di difisa di chianti nun siguìru lu percorsu nurmativu dû raggiunamentu diduttivu iputèticu, unni li privisioni chiavi èranu ô stissu liveḍḍu di anàlisi (3) e foru tistati spirimintarmenti pi fari prugridiri lu ciclu appressu di sbiluppu tiòricu (4). Li limitazziuni tecnichi limitunu la ricota dî dati a spicifici catigurìi metabolichi e escludunu l'analisi cumpleta dî metabboliti spicializzati, evitannu accussì li cunfrunti intercatigurìi ca sunnu essenziali pò sviluppu tiuricu (5). La mancanza di dati mitabbòmici cumpleti e na valuta cumuni pi cunfruntari lu flussu di travagghiu di prucidura dû spazziu mitabbolicu ntra gruppi di chianti diversi frena la maturità scientifica dû campu.
L'urtimi sviluppi ntò campu dâ metabbulumica dâ spettrumetria di massa tandem (MS/MS) ponnu carattirizzari cumpletamenti li canciamenti metabbolici dintra e tra li speci di nu certu clade di sistema e ponnu essiri cumminati cu metudi computazziunali pi calculari la sumigghianza strutturali tra sti misceli cumplessi. Canuscenza pricidenti dâ chìmica (5). La cumminazziuni di tecnologgìi avanzati ntà l'analisi e lu computing duna na struttura nicissària pi li provi a longu termini di tanti privisioni fatti dî tiurii eculoggici e evuluzziunari dâ divirsità metabolica. Shannon (6) ‘ntruducìu a tiurìa dâ ‘nformazzioni pâ prima vota nnô sò artìculu funnamintali ntô 1948, mittennu li basi pì l'analisi matimàtica dâ ‘nformazzioni, ca fu usata ‘n tanti campi addiversi dâ sò applicazzioni origginària. Ntâ ginòmica, a tiurìa dâ ‘nformazzioni fu applicata cu successu pì quantificari li ‘nformazzioni cunservatrici dâ siquenza (7). Ntâ ricerca dâ trascrittòmica, la tiurìa dâ nfurmazzioni analizza li canciamenti cumplissivi ntô trascrittuma (8). Nna ricerchi pricidenti, applicamu la struttura statìstica dâ tiuria di l'infurmazzioni â mitabbulumica pi discrìviri l'espertizza mitabbòlica dû liveḍḍu tissutali nne chianti (9). Ccà, cumminamu lu flussu di travagghiu basatu ncapu MS/MS câ struttura statìstica dâ tiuria di l'infurmazzioni, caratterizzata dâ divirsità mitabbòlica nnâ valuta cumuni, pi cunfruntari li privisioni chiavi dâ tiuria dâ difisa di chianti dû mitabbulumu induttu di l'erbivori.
Li quatri tiòrici dâ difisa di chianti di sòlitu su' ricìprocamenti nclusivi e si ponnu spartuti nta du' catigurìi: chiḍḍi ca cercanu di schicari la distribbuzzioni di mitabboliti spicìfici di chianti basati ncapu li funziuna di difisa, comu la difisa ottimali (OD) (10), lu birsagghiu muventi (MT) (11) ) E l'aspettu di comu cancianu li miccanichi (12) la dispunibbilità nfruenza la criscita di chianti e l'accumulu di mitabboliti spicializzati, comu lu carboniu: ipotisi di l'equilìbbriu nutritivi (13), l'ipotisi dû tassu di criscita (14), e l'ipotisi di l'equilìbbriu di criscita e diffirenziazziuni (15). Li dui ‘nzèmi ri tiurìi sunnu a liveddi ri analisi addiversi (4). Cumunca, du' tiurii ca pigghianu funziuna difinsivi a liveḍḍu funziunali duminanu la cunversazzioni ncapu li difisi custitutivi e nnutcibbili di chianti: la tiuria OD, ca prisupponi ca li chianti nvistunu nne so difisi chimichi cari sulu quannu serbi, pi diri, quannu su' ngrigiti Quannu n'armali d'erba attacca, pirciò, sicunnu la pussibbilità di funzioni è assignata (10); l'ipotisi MT pruponi ca non c'è n'assi di canciamentu dirizziunali dû metabbolitu, ma lu metabbolitu cancia a casu, criannu accussì la pussibbilità d'ostruiri lu "birsagghiu di muvimentu" metabbolicu d'attaccari l'erbivori. Nta autri paroli, sti du tiurìi fannu privisioni opposti supra lu rimudellu metabbolicu ca si virifica doppu l'attaccu di l'erbivori: la rilazziuni tra l'accumulu unidirziunali dî metabboliti cu funziuni difinsiva (DO) e canciamenti metabbolici non diriggiuti (MT) (11 ).
L'ipotisi OD e MT pigghiunu non sulu li canciamenti indutti ntà lu metabbuluma, ma puru li cunsiquenzi eculoggici e evulutivi di l'accumulu di sti metabboliti, comu li costi adattivi e li binifici di sti canciamenti metabbolici ntà n'ambienti eculoggicu spicificu (16). Puru si tutti dui l'ipotisi arricanusciunu la funziuni difinsiva dî metabboliti spicializzati, ca ponnu o non ponnu essiri cari, la privisioni chiavi ca distingui l'ipotisi OD e MT è ntà dirizziunalità dî canciamenti metabbolici indutti. A privisioni dâ tiurìa dâ OD havi ricivutu l’attinzioni cchiù spirimentali finu a ora. Sti provi nchiùjinu lu studiu di funziuna di difisa diretta o nniretta di tissuti diversi di cumposti spicìfici nne sirri e cunnizzioni naturali, accussì comu canciamenti nnô stadiu di sbiluppu di chianti (17-19). Com'è gghiè, finu a ora, a causa dâ mancanza di nu flussu di travagghiu e nu quatru statisticu pi l'analisi cumpleta glubbali dâ divirsità metabolica di quarsiasi organismu, la privisioni dâ diffirenza principali tra li du tiurìi (azzoè la dirizziuni dî canciamenti metabbolici) arresta di essiri virìficata. Ccà, furniamu n'analisi accussì.
Una dî carattirìstichi cchiù mpurtanti di mitabboliti spicìfici di chianti è la so divirsità strutturali estrema a tutti li liveḍḍi di chianti sìnguli, pupulazzioni a speci simili (20). Assà canciamenti quantitativi nté metabboliti spicializzati si ponnu ossirvari ntà scala dâ populazziuni, mentri li forti diffirenzi qualitativi di solitu si mantènunu ntà lu livellu dâ speci (20). Pirciò, la divirsità mitabbòlica di chianti è l'aspettu principali dâ divirsità funziunali, ca rifletti l'adattabbilità a nicchi diversi, spicialmenti chiḋḋi cu pussibbilità di nvasiuni diversi di nzetti spiciali e erbivori cumuni (21). Dô articulu rivoluzzionariu di Fraenkel (22) ncapu li mutivazzioni di l'esistenza di mitabboliti spicifici di chianti, li ntirazzioni cu vari nzetti foru cunzidirati comu prissioni di silizzioni mpurtanti, e si cridi ca sti ntirazzioni furmaru li chianti duranti l'evuluzzioni. Via mitabòlica (23). Li diffirenzi interspeci ntà divirsità di metabboliti spicializzati ponnu puru riflèttiri l'equilìbbriu fisiuloggicu assuciatu â difisa custitutiva e inducibbili dî chianti contra li stratiggìi erbivori, picchì li du speci sunnu spissu currilati nigativamenti l'una cu l'autra (24). Puru si putissi èssiri vantaggiusu mantèniri na bona difisa sempri, li canciamenti mitabbolici puntuali assuciati â difisa dannu binifici chiari pirmittennu ê chianti di stanziari risursi prizziusi a autri nvistimenti fisiuloggici (19, 24), e evitari lu bisognu di simbiusi. Dannu cullatirali (25). Nortri, sti riorganizzazziuni dî metabboliti spicializzati causati di l'insetti erbivori ponnu purtari a na distribbuzziuni distruttiva ntà populazziuni (26), e ponnu riflèttiri litturi diretti di canciamenti naturali sustanziali ntò signali di l'acidu jasmonicu (JA), ca pò essiri mantinutu ntà populazziuni. Li signali JA auti e vasci sunnu compromissi tra difisa contra l'erbivori e cuncurrenza cu speci spicifici (27). Nortri, li vie biusintetici dî metabboliti spicializzati subbisciunu na pèrdita e na trasfurmazziuni rapida duranti l'evuluzziuni, purtannu a na distribbuzziuni metabolica irregulari tra li speci imparintati di vicinu (28). Sti polimurfismi ponnu essiri stabbiliti rapidamenti comu risposta ê canciamenti dî schemi erbivori (29), ca signìfica câ fluttuazziuni dî cumunità erbivori è nu fatturi chiavi ca spinci l'eterogginità metabolica.
Cca, arrisurbimu spicificamenti li prubblemi siquenti. (I) Comu l'insettu erbivuru ricunfigura lu mitabbulumu di chianti? (Ii) Quali sunnu li cumpunenti principali di l'informazziuni dâ plasticità metabolica ca ponnu essiri quantificati pi pruvari li privisioni dâ tiurìa dâ difisa a longu termini? (Iii) Si riprugrammari lu metabbulumu di chianti nna na manera unica pi l'attaccanti, si è accussì, quali rolu joca l'urmuna di chianti pi adattari na certa risposta mitabbòlica, e quali metabboliti cuntribbuisciunu â spicificità dâ difisa dâ speci? (Iv) Siccomu li privisioni fatti di tanti tiurii di difisa ponnu essiri allargati ntà tutti li livelli dî tissuti biuloggici, dumannamu quantu è coerenti la risposta metabolica causata dû cunfrontu internu ô cunfrontu interspeci? A stu scopu, studiamu sistimaticamenti lu mitabbulumu di fogghi dâ nicutina dû tabbaccu, ca è na chianta mudellu eculòggica cu nu mitabbulismu spicializzatu riccu, ed è efficaci contra li larvi di du' erbivori nativi, li Lepidoptera Datura (Ms) (Assai aggrissivi, principalmenti manciati) Supra li Solanaceae e li Spodoton "genus", cu chianti òspiti di Sulanaceae e autri òspiti di autri gèniri e famigghi Alimentu di chianti. Analizzàmu u spettru dâ metabbolòmica MS/MS e estraemu li discrittura statìstici dâ tiurìa dâ ‘nformazzioni pì cunfruntari li tiurìi OD e MT. Criari mappi di spicificità pi rivilari l'identità dî metabboliti chiavi. L'analisi fu allargata â pupulazzioni nativa di N. nasi e speci di tabbaccu strittamenti imparintati pi analizzari ultiriurmenti la cuvarianza ntra la signalazzioni di l'urmuna di chianti e l'induzzioni di OD.
Pî acquisiri na mappa cumplissiva ncapu la plasticità e la struttura dû mitabbulumu di fogghi di tabbaccu erbivuru, usamu n'anàlisi e un flussu di travagghiu di càrculu sbiluppatu prima pi arricogghiri e dicunvoltari cumpletamenti dati a risuluzzioni auta spettri MS/MS nnipinnenti di estratti di chianti ( 9 ). Stu mètudu nun diffirinziatu (chiamatu MS/MS) po custrujiri spettri cumposti nun ridunnanti, ca poi ponnu èssiri usati pi tutti l’anàlisi a liveḍḍu cumpostu discritti cca. Sti mitabboliti di chianti dicunvuluti su' di vari tipi, cumposti di cintinara o migghiara di mitabboliti (circa 500-1000-s/MS/MS ccà). Ccà, cunsidiramu la plasticità metabbolica ntà struttura dâ tiuria di l'informazziuni e quantificamu la divirsità e la prufissiunalità dû metabbulumu basatu ntà l'entropia di Shannon dâ distribbuzziuni dâ friquenza metabbolica. Usannu la furmula pricidentimenti mprimintata (8), calculamu nu nzemi d'innicaturi ca ponnu essiri usati pi quantificari la divirsità metabbolica (innicaturi Hj), la spicializzazziuni dû profilu metabbolicu (innicaturi δj) e la spicificità metabbolica di nu singulu metabbolitu (innicaturi Si). Sparti, applicamu l'Indici di Plasticità A Distanza Rilativa (RDPI) pi quantificari l'inducibbilità dû metabbulumu di l'erbivori (Figura 1A) (30). Nna chista struttura statìstica, trattamu lu spettru MS/MS comu unità di nfurmazzioni di basi, e prucissamu l'abbunnanza rilativa di MS/MS nna na mappa di distribbuzzioni di friquenza, e poi usamu l'intrupìa di Shannon pi stimari la divirsità metabbuloma di chista. La spicializzazziuni dû metabbuluma è misurata dâ spicificità media di nu singulu spettru MS/MS. Pirciò, l'aumentu di l'abbunnanza di quarchi classi MS/MS doppu l'induzziuni di l'erbivori si trasforma ntà inducibbilità spettrali, RDPI e spicializzazziuni, ca è l'aumentu di l'indici δj, picchì si pruducunu metabboliti cchiù spicializzati e si pruduci n'indici Si jautu. L'abbasciamentu di l'indici di divirsità Hj rifletti ca o lu nùmmaru di MS/MS ginirati è ridduttu, o la distribbuzzioni dâ friquenza dû prufilu cancia nta na dirizzioni cchiù picca uniformi, arridducennu ô stissu tempu la so ncirtizza cumplissiva. Ntraversu lu càrculu dû ‘ndici Si, è pussìbbili suttaliniari quali MS/MS sunnu ‘ndutti ri arcuni erbivori, ô cuntrariu, quali MS/MS nun rispùnni â ‘nduzzioni, ca è n’innicaturi chiavi pì discèrniri privisioni ri MT e OD.
(A) Discritturi statìstici usati pi l'inducibbilità dî dati MS/MS (RDPI) di l'erbivori (H1 a Hx), la divirsità (indici Hj), la spicializzazziuni (indici δj) e la spicificità dî metabboliti (indici Si). N'aumentu dû gradu di spicializzazziuni (δj) innica ca, ntà media, si pruduciunu cchiù metabboliti spicifici erbivori, mentri na diminuzziuni dâ diversità (Hj) innica na diminuzziuni ntà produzziuni dî metabboliti o na distribbuzziuni irregulari dî metabboliti ntà mappa di distribbuzziuni. Lu valuri di Si valuta si lu metabbolitu è ​​spicificu pi na certa cunnizziuni (ccà, erbivoru) o ô cuntrariu mantinutu ntò stissu livellu. (B) Diagramma cuncittuali dâ privisioni dâ tiurìa dâ difisa usannu l'assi dâ tiurìa dâ ‘nformazzioni. La tiurìa OD prividi ca l'attaccu di l'erbivori aumintarà li metabboliti di difisa, aumintannu accussì δj. Ntò stissu tempu, l'Hj diminuisci picchì lu profilu è riorganizzatu versu l'incertezza ridutta di l'informazziuni metabolichi. La tiurìa MT prividi ca l'attaccu di l'erbivori causarà canciamenti non dirizziunali ntà lu metabbuluma, aumintannu accussì Hj comu innicaturi di n'incertezza aumintata di l'informazziuni metabolichi e causannu na distribbuzziuni casuali di Si. Prupunìumu puru nu mudellu mistu, lu megghiu MT, aunni certi metabboliti cu valuri difinsivi cchiù jauti sunnu particularmenti aumintati (valuri Si jautu), mentri autri mustranu risposti casuali (valuri Si cchiù vasciu).
Usannu li discritturi dâ tiurìa di l'informazziuni, interpretramu la tiurìa dâ OD pi prividiri ca li canciamenti dî metabboliti spiciali indutti di l'erbivori ntà nu statu custitutivu non induttu purterànu a (i) n'aumentu dâ spicificità metabbolica (indici Si) ca spinci la spicificità metabbonòmica (indici δj) L'aumentu di) certi gruppi di metabboliti spiciali e nu valuri di difisa cchiù jauta (divirsità). indici) a causa dû canciamentu dâ distribbuzziuni dâ friquenza metabolica a cchiù distribbuzziuni dû corpu dâ leptina. A livellu di nu singulu metabbolitu, è privista na distribbuzziuni di Si ordinata, aunni lu metabbolitu aumintarà lu valuri di Si a secunna dû sò valuri di difisa (Figura 1B). Ntà chista linia, spiegamu la tiuria MT pi prividiri ca l'eccitazziuni purterà a (i) canciamenti non dirizziunali ntà li metabboliti ca portunu a na diminuzziuni di l'indici δj e (ii) n'aumentu di l'indici Hj a causa di n'aumentu di l'incirtizza metabolica. O casualità, ca pò èssiri quantificata dâ ‘ntrupìa ri Shannon sutta forma ri diversità giniralizzata. Pi quantu riguarda la cumpusizziuni metabolica, la tiuria MT prividi la distribbuzziuni casuali di Si. Tenennu cuntu ca certi metabboliti sunnu sutta cunnizziuni spicifici sutta cunnizziuni spicifici, e autri cunnizziuni non sunnu sutta cunnizziuni spicifici, e lu sò valuri di difisa dipenni di l'ambienti, prupunìumu puru nu mudellu di difisa mista, aunni δj e Hj sunnu distribbuiti ntà dui longu Si Aumentu ntà tutti li dirizziuni, sulu certi gruppi metabboliti casuali aumintanu nu valuri di difisa particulari, ca hannu nu valuri di difisa autu Si, ca hannu nu valuri di difisa particulari. distribbuzzioni (Figura 1B).
Pî pruvari la privisioni dâ tiurìa dâ difisa ridifinuta ntà l'assi dû discritturi dâ tiurìa di l'infurmazzioni, allivamu larvi erbivori esperti (Ms) o giniralisti (Sl) ntà li fogghi di Nepenthes pallens (Figura 2A). Usannu l'analisi MS/MS, ricupiramu 599 spettri MS/MS nun ridunnanti (file di dati S1) di estratti di mitanolu di tissuti di fogghi arricugghiuti doppu l'alimentazzioni di caterpillar. Usannu l’indici RDPI, Hj e δj pi visualizzari la ricunfigurazzioni dû cuntinutu di nfurmazzioni nnî file di cunfigurazzioni MS/MS rivela schemi ntirissanti (Figura 2B). La tinnenza cumplessiva è ca, comu discrivutu dû discritturi di l'informazziuni, mentri li caterpillar continuunu a manciari li fogghi, lu gradu di tutta la riorganizzazziuni metabolica aumenta ntò tempu: 72 uri doppu ca l'erbivoru mancia, lu RDPI aumenta assà. Ô cunfrontu dû cuntrollu non danneggiatu, Hj fu assà riduttu, ca fu duvutu ô gradu di spicializzazziuni aumintatu dû profilu metabbolicu, ca fu quantificatu di l'indici δj. Chista tinnenza apparenti è coerenti cchî privisioni dâ tiurìa OD, ma è incoerenti cchî privisioni principali dâ tiurìa MT, ca criri ca li canciamenti casuali (non dirizziunali) ntà li livelli dî metabboliti sunnu usati comu camuffaggiu difinsivi (Figura 1B). Puru si lu cuntinutu elicituri dâ siccizziuni orali (OS) e lu cumportamentu di l'alimentazziuni di sti du erbivori sunnu diversi, lu sò alimentazziuni direttu purtau a canciamenti simili ntà li dirizziuni di Hj e δj duranti li piriudi di raccolta di 24 uri e 72 uri. L'unica diffirenza si virificàu a 72 uri di RDPI. Ô cunfrontu di chiḋḋu causatu di l'alimentazziuni Ms, lu metabbulismu cumplissivu induttu di l'alimentazziuni Sl era cchiù jautu.
(A) Pruggettu spirimintali: l'erbivori di porci cumuni (S1) o esperti (Ms) su' alimintati cu fogghi disalinati di chianti di vasu, mentri pi l'erbivori simulati, lu sistema upirativu di Ms (W + OSM) veni usatu pi manijari la puntura di pusizzioni standardizzati di fogghi firiti. Larvi S1 (W + OSSl) o acqua (W + W). Lu cuntrollu (C) è na fogghia nun danneggiata. (B) Inducibbilità (RDPI rispettu ô graficu di cuntrollu), divirsità (indici Hj) e spicializzazziuni (indici δj) l'indici calculatu pâ mappa dî metabboliti spiciali (599 MS/MS; file di dati S1). L'astirisci ìnnicanu diffirenzi significativi ntra l'alimentazziuni diretta di l'erbivori e lu gruppu di cuntrollu (test t dû studenti cû test t accuppiatu, *P<0,05 e ***P<0,001). ns, nun è mpurtanti. (C) L'indici di risuluzzioni dû tempu principali (scatula blu, amminuacidi, àciti urganici e zùccaru; file di dati S2) e spettru dî metabboliti spiciali (scatula russa 443 MS/MS; file di dati S1) doppu lu trattamentu simulatu di l'erbivori. La fascia di culura si rifirisci ô ntirbaḍḍu di cunfidenza dû 95%. L'astiriscu ‘nnica a diffirenza significativa ntra u trattamentu e u cuntrollu [analisi quatràtica dâ varianza (ANOVA), assicutata dâ diffirenza onestamenti significativa ri Tukey (HSD) pì cunfrunti mùrtipli post hoc, *P<0,05, **P<0,01 e *** P <0,001]. (D) Spicializzazzioni dî grafici ri diffusioni e prufili ri metabboliti spiciali (campioni ripituti cu trattamenti addiversi).
Pi esplurari si lu rimudellu induttu di l'erbivori a livellu di metabbulu si rifletti ntà li canciamenti ntà lu livellu di metabboliti innividuali, prima si cuncintraru nté metabboliti studiati prima nté fogghi di Nepenthes pallens cu na risistenza di l'erbivori dimustrata. L'amidi finòlici sunnu coniugati idrossicinnamamida-poliamina ca s'accumulunu duranti lu prucessu erbivoru di l'insetti e sunnu canusciuti pi ridduciri lu rinnimentu di l'insetti (32). Circamu li pricursuri dî currispunnenti MS/MS e tracciamu li sò curbi cinètichi cumulativi (Figura S1). Non c'è di maravigghiari ca li dirivati ​​dû finolu ca nun sunnu direttamenti coinvolti ntà difisa contra l'erbivori, comu l'acidu cloruggènicu (CGA) e la rutina, sunnu sutta-rigulati doppu l'erbivori. Ô cuntrariu, l'erbivori ponnu fari l'amidi di finolu assà putenti. L'alimentazziuni cuntinua dî du erbivori purtau a quasi lu stissu spettru d'eccitazziuni dî finulamidi e stu schema era assà chiaru pà sintisi de novo dî finulamidi. Lu stissu finòminu si ossirva quannu si esplora lu percorsu dî glicosidi ditirpeni 17-idrossigiranili nonanedioli (17-HGL-DTG), ca pruduci nu granni nummuru di ditirpeni aciclici cu funziuni anti-erbivori efficaci (33), di cui la signura Feeding havi n'esprissiuni simili a Sl Fig.
Lu pussibbili svantaggiu di spirimenti di alimentazzioni diretta di l'erbivori è la diffirenza ntô tassu di cunsumu di fogghi e ntô tempu di alimentazzioni di l'erbivori, ca renni difficili eliminari l'effetti spicifici di l'erbivori causati di firiti e erbivori. Pî arrisòrbiri megghiu la spicificità di speci erbivori dâ risposta mitabbòlica indutta dî fogghi, simulamu l'alimentazzioni di larvi Ms e Sl applicannu subbitu l'OS appena arricugghiutu (OSM e OSS1) â puntura standard W di pusizzioni custanti dî fogghi. Chista prucidura è chiamata trattamentu W + OS e standardizza l'induzziuni cronometrannu pricisamenti l'inizziu dâ risposta elicitata di l'erbivoru senza causari effetti cunfusionari dî diffirenzi ntà prubabbilità o quantità di pèrdita di tissuti (Figura 2A) (34). Usannu l'anàlisi MS/MS e lu pipeline di càrculu, ricupiràmu 443 spettri MS/MS (file di dati S1), ca si suvrapponìanu cû spettru pricidentimenti assemblatu di spirimenti di alimentazzioni diretta. L'analisi dâ tiuria di l'infurmazzioni di stu nzemi di dati MS/MS mustrau ca la riprugrammazziuni dî metabbulumi spicializzati nté fogghi simulannu l'erbivori mustrau n'induzziuni spicifici dû sistema upirativu (Figura 2C). In particulari, rispettu ô trattamentu OSS1, l'OSM pruvucau nu miglioramentu dâ spicializzazziuni dû metabbolomu a 4 uri. Si va a nutari ca rispettu ô nzemi di dati spirimintali di l'alimentazziuni diretta di l'erbivori, la cinètica metabbolica visualizzata ntà lu spazziu bidiminsiunali usannu Hj e δj comu cuurdinati e la dirizziunalità dâ spicializzazziuni dû metabbulumu comu risposta ô trattamentu simulatu di l'erbivori ntò tempu Aumenta custanti (Figura 2D). Ntô stissu tempu, quantificamu lu cuntinutu di l'amminuacidi, l'acidi urganici e li zùccari (file di dati S2) pi capiri si st'aumentu miratu ntà l'espertizza dû metabbulu è duvutu â ricunfigurazziuni dû metabbulismu dû carboniu cintrali comu risposta a l'erbivori simulati (Figura S2). Pi spricari megghiu stu schema, monitoramu ultiriurmenti la cinètica di l'accumulu metabolicu dî vie finulamidi e 17-HGL-DTG discussi prima. L'induzziuni spicifica di l'OS di l'erbivori si trasforma ntà nu schema di riarrangiamentu diffirinziali ntà lu metabbulismu dî finulamidi (Figura S3). L'amidi finòlici ca cuntenunu frazziuni di cumarina e caffioili sunnu prifirinziarmenti indutti di OSS1, mentri l'OSM attivanu n'induzziuni spicifica di coniugati di firulili. Pû percorsu 17-HGL-DTG, fu rilivata l'induzziuni diffirinziali dû SO di prudutti di malunilazziuni e dimalunilazziuni a valli (Figura S3).
Appoi, studiamu la plasticità dû trascrittu nnùtta dû sistema upirativu usannu lu nzemi di dati di microarray dû cursu dû tempu, ca simula l'usu di OSM pi trattari li fogghi di fogghi di chianti rusetta nne erbivori. A cinètica dû campionamentu si suvrapponi ‘n basi â cinètica usata nnî stu sturìu ri metabbolòmica (35). 'N paraguni câ ricunfigurazziuni dû metabbolomu aunni la plasticità metabbolica è particularmenti aumintata ntò tempu, ossirvamu scuppi di trascrizziuni transienti nté fogghi indutti di Ms, aunni l'inducibbilità dû trascrittuma (RDPI) e la spicializzazziuni (δj) sunnu a 1 Ci fu n'aumentu significativu ntà l'uri, e la divirsità (Hj) siguìu l'esprissiuni significativamenti ridutta di BMP1, lu rilazziuni BMP1, di spicializzazziuni dû trascrittuma (Figura S4). Li famigghi di geni metabbolici (comu la P450, la glicosiltransfirasi e l'aciltransfirasi BAHD) partècipunu ô prucessu d'assimblaggiu di metabboliti spiciali di unità strutturali dirivati ​​dû metabbulismu primariu, siguennu lu mudellu di spicializzazziuni primitiva supramenziunatu. Comu casu di studiu, fu analizzata la via dâ finilalanina. L'analisi cunfirmò ca li geni principali ntô metabbulismu dâ finulamida su' assà indutti di l'OS ntà l'erbivori rispettu ê chianti non attirati e su' alliniati strittamenti ntà li so schemi d'esprissiuni. Lu fatturi di trascrizziuni MYB8 e li geni strutturali PAL1, PAL2, C4H e 4CL ntà valli di stu percorsu mustraru n'inizziu primu dâ trascrizziuni. L'aciltransfirasi ca hannu nu rolu ntà l'assimblaggiu finali dâ finulamida, comu AT1, DH29 e CV86, mustranu nu schema di upregulazziuni prulungatu (Figura S4). L'osservazziuni supra innicanu ca l'inizziu primu dâ spicializzazziuni dû trascrittuma e lu miglioramentu succissivu dâ spicializzazziuni dâ metabbolòmica sunnu na modalità accuppiata, ca pò essiri duvuta ô sistema rigulaturi sincrunu ca accumincia na risposta di difisa putenti.
La ricunfigurazzioni nnâ signalazzioni urmunali di chianti si cumporta comu stratu rigulaturi ca ntigra nfurmazzioni di l'erbivori pi riprugrammari la fisiuluggìa di chianti. Doppu la simulazzioni di l'erbivori, misuramu li dinàmichi cumulativi di catigurìi urmunali chiavi di chianti e visualizzamu la cu-esprissiuni timpurali ntra iḍḍi [cufficenti di currilazzioni di Pearson (PCC)> 0,4] (Figura 3A). Comu privistu, l'urmuna di chianti lijati â biusintisi su' allazzati dintra la riti di cu-esprissiuni di l'urmuna di chianti. Sparti, la spicificità mitabbòlica (indici Si) è mappata a sta riti pi suttaliniari l'urmuna di chianti indutti di trattamenti diversi. Du ari principali dâ risposta spicifica di l'erbivori sunnu disignati: una è ntò gruppu JA, aunni JA (la sò forma biuloggicamenti attiva JA-Ile) e autri dirivati ​​JA mustranu lu punteggiu Si cchiù jautu; l'autru è l'etileni (ET). La gibbirillina mustrò sulu n'aumentu muderatu ntà spicificità di l'erbivori, mentri autri urmuna di chianti, comu la cituchinina, l'auxina e l'acidu abscisicu, avìunu na spicificità d'induzzioni vascia pi l'erbivori. Ô cunfrontu di usari sulu W + W, l'amplificazzioni dû valuri màssimu dî dirivati ​​di JA attraversu l'applicazzioni OS (W + OS) po èssiri trasfurmata nta n'innicaturi spicìficu forti di JA. Inaspittatamenti, OSM e OSS1 cu cuntinutu elicituri diffirenti sunnu canusciuti pi causari n'accumulu simili di JA e JA-Ile. Ô cuntrariu di l'OSS1, l'OSM è spicificamenti e fortimenti induttu dî OSM, mentri l'OSS1 non amplifica la risposta dî firiti basali (Figura 3B).
(A) Analisi dâ riti di cu-esprissiuni basata ncapu lu càrculu PCC dâ simulazzioni cinètica di l'accumulu di l'urmuna di chianti indutta di l'erbivori. Lu nodu rapprisenta un sulu urmuna di chianti, e la grannizza dû nodu rapprisenta l'indici Si spicìficu di l'urmuna di chianti ntra li trattamenti. (B) Accumulu di JA, JA-Ile e ET nne fogghi causatu di trattamenti diversi nnicati di culura diversi: albicocca, W + OSM; blu, W + OSSl; nìuru, W + W; grigiu, C (cuntrollu) . L'astirisci ‘nnicanu diffirenzi ‘mpurtanti ntra trattamentu e cuntrollu (ANOVA a dui vie siguita dû cunfrontu mùrtiplu post hoc ri Tukey HSD, *** P <0,001). Analisi dâ tiurìa di l'infurmazzioni di (C)697 MS/MS (file di dati S1) nnâ biusintisi di JA e spettru di pircizzioni nfiriuri (irAOC e irCOI1) e (D)585 MS/MS (file di dati S1) ntà ETR1 cu signali ET nfiriuri Du' chianu di cuntrollu di linia erbivori simulati e chianu EV attivatu. L'astirisci ‘nnicanu diffirenzi significativi ntra lu trattamentu W+OS e lu cuntrollu nun danneggiatu (ANOVA a dui vie siguita dû cunfrontu mùrtiplu post hoc di Tukey HSD, *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001). (E) Grafici diffusi ri opposizzioni diffusa â spicializzazzioni. Li culura sunu vari ceppi gineticamenti modificati; li sìmmuli rapprisèntanu mètudi di trattamentu diversi: triàngulu, W + OSS1; rittàngulu, W + OSM; circulu C
Appoi, usamu un ceppu gineticamenti mudificatu di Nepenthes attenuati (irCOI1 e sETR1) nne fasi chiavi dâ biusintisi di JA e ET (irAOC e irACO) e la pircizzioni (irCOI1 e sETR1) pi analizzari lu mitabbulismu di sti du' urmuna di chianti ncapu lu cuntribbutu di riprugrammazzioni di l'erbivori. Coerenti cu spirimenti pricidenti, cunfirmamu l'induzzioni di l'erbivori-OS nne chianti purtaturi vacanti (EV) (Figura 3, C a D) e la diminuzzioni cumplissiva di l'indici Hj causatu di l'OSM, mentri l'indici δj aumintau. La risposta è cchiù marcata dâ risposta attivata di OSS1. Un gràficu a du’ lini usannu Hj e δj comu cuurdinati mustra la dirigulazzioni spicìfica (Figura 3E). La tinnenza cchiù ovvia è ca nté ceppi senza signali JA, la divirsità metabbuloma e li canciamenti di spicializzazziuni causati di l'erbivori sunnu quasi completamenti eliminati (Figura 3C). Ô cuntrariu, la pircizzioni di ET silenziusa nne chianti sETR1, puru si l'effettu cumplessivu ncapu li canciamenti nnô mitabbulismu erbivoru è assai cchiù vasciu di chiḋḋu dâ signalazziuni JA, attenua la diffirenza ntà l'indici Hj e δj ntra l'eccitazziuni OSM e OSS1 (Figura 3D e Figura S5). . Chistu innica ca ortri â funziuni cintrali dâ trasduzziuni dû signali JA, la trasduzziuni dû signali ET servi puru comu sintonizzazziuni dâ risposta metabolica spicifica dâ speci di l'erbivori. Coerenti cu sta funzioni di sintunamentu, nun ci fu nuḍḍu canciamentu nnâ nnucibbilità cumplissiva dû metabbuluma nne chianti sETR1. Di n'autra banna, rispettu a chianti sETR1, li chianti irACO pruvucaru ampitùdini cumplissivi simili di canciamenti mitabbolici causati di l'erbivori, ma mustraru punteggi Hj e δj assai diversi ntra sfidi OSM e OSS1 (Figura S5).
Pî identificari li metabboliti spicializzati ca hannu cuntribbuti mpurtanti â risposta spicifica dâ speci di l'erbivori e perfezziunari la sò produzziuni attraversu li signali ET, usamu lu mètudu strutturali MS/MS sviluppatu pricidentimenti. Chistu mètudu si basa supra lu mètudu di bi-clustering pi ri-didurri la famigghia metabolica dî frammenti MS/MS [pruduttu a punti nurmalizzatu (NDP)] e lu punteggiu di sumigghianza basatu ntà pèrdita niutrali (NL). Lu nzemi di dati MS/MS custrujutu ntraversu l'analisi di lini transgènichi ET pruduciu 585 MS/MS (file di dati S1), ca fu arrisurbutu aggruppannuli nta setti moduli principali MS/MS (M) (Figura 4A). Cirtuni di sti moduli sunnu densamenti chini di metabboliti spiciali pricidentimenti caratterizzati: pir esempiu, M1, M2, M3, M4 e M7 sunnu ricchi di vari dirivati ​​di finolu (M1), glicosidi flavunoidi (M2), zùccari acili (M3 e M4) e 17-HGL-DTG (7M). Sparti, l'infurmazziuni spicifici metabolichi (indici Si) di nu singulu metabbolitu ntà ogni modulu è calculata e la sò distribbuzziuni di Si pò essiri viduta intuitivamenti. In brevi, li spettri MS/MS ca mustranu n'auta spicificità di l'erbivori e dû ginutipu sunnu caratterizzati di valuri di Si auti e li statistichi di curtosi innicanu la distribbuzziuni dû pilu ntà l'angulu dâ cuda dritta. Na distribbuzzioni culloidi magra accussì fu truvata ntà M1, aunni l'amidu di finolu mustrau la frazziuni cchiù auta di Si (Figura 4B). Lu 17-HGL-DTG inducibbili erbivoru citatu prima ntà M7 mustrau nu punteggiu Si muderatu, ca innica nu gradu muderatu di rigulazziuni diffirinziali ntra li du tipi di sistema upirativu. Ô cuntrariu, la maggiuranza dî metabboliti spicializzati prudutti custitutivamenti, comu la rutina, lu CGA e li zùccari acili, sunnu tra li punteggi cchiù vasci di Si. Pî esplurari megghiu la cumplessità strutturali e la distribbuzziuni di Si tra metabboliti spiciali, fu custruiuta na riti muliculari pi ogni modulu (Figura 4B). Na privisioni mpurtanti dâ tiuria OD (riassunta ntà figura 1B) è ca la riorganizzazziuni dî metabboliti spiciali doppu l'erbivori avissi a purtari a canciamenti a sensu unicu nté metabboliti cu nu valuri di difisa jautu, spicialmenti aumintannu la sò spicificità (ô cuntrariu dâ distribbuzziuni casuali) Modu) metabboliti difinsivi privistu dâ tiuria MT. La maggiuranza dî dirivati ​​di finolu accumulati ntà M1 sunnu funziunalmenti ligati ô diclinu dû rinnimentu di l'insetti (32). Quannu si cunfruntamu li valura di Si nne metabboliti M1 ntra li fogghi indutti e li fogghi custituenti di chianti di cuntrollu EV a 24 uri, ossirvamu ca la spicificità mitabbolica di tanti metabboliti doppu l'insetti erbivori àvi na tinnenza di aumentu mpurtanti (Figura 4C). L'aumentu spicìficu dû valuri di Si fu truvatu sulu ntà li finulamidi difinsivi, ma non fu truvatu n'aumentu dû valuri di Si ntà autri finoli e metabboliti scanusciuti ca coesistìunu ntà stu modulu. Chistu è nu modellu spicializzatu, ca è currilatu â tiurìa dâ OD. Li privisioni principali dî canciamenti metabbolici causati di l'erbivori sunnu coerenti. Pî pruvari si sta particularità dû spettru finulamidicu fu indutta di l'ET spicificu dû OS, tracciamu l'indici Si dû metabbolitu e causamu nu valuri d'esprissiuni diffirinziali ntra OSM e OSS1 ntà li ginutipi EV e sETR1 (Figura 4D). Ntà sETR1, la diffirenza indutta dâ finamida tra OSM e OSS1 fu assà ridutta. Lu mètudu di bi-clustering fu applicatu puru ê dati MS/MS arricugghiuti ntà ceppi cu JA insufficienti pi didurri li moduli principali MS/MS ligati â spicializzazziuni metabolica rigulata dô JA (Figura S6).
(A) Li risultati di raggruppamentu di 585 MS/MS basati ncapu lu frammentu cunnivisu (simigghianza NDP) e la pèrdita niutrali cunnivisa (simigghianza NL) portunu ô modulu (M) ca è coerenti câ famigghia cumposta canusciuta, o cu na cumpusizziuni metabboliti scanusciuta o scarsamenti metabbulizzata. Vicinu a ogni modulu, si vidi la distribbuzziuni spicìfica dû metabbolitu (MS/MS) (Si). (B) Riti muliculari mudulari: li nodi riprisèntanu MS/MS e li cunfini, li punteggi MS/MS NDP (russu) e NL (blu) (cut-off,> 0,6). L'indici di spicificità metabbolitica graduatu (Si) culuratu ntà basi dû modulu (a manu manca) e mappatu ntà riti muliculari (a manu dritta). (C) Modulu M1 dâ chianta EV nnô statu custitutivu (cuntrollu) e nnuttu (erbivoru simulatu) a 24 uri: schema di riti muliculari (lu valuri di Si è la grannizza dû nodu, la finulamida difinsiva è suttaliniata cu blu). (D) Lu schema dâ riti muliculari M1 dâ linia dû spettru sETR1 cu na pircizzioni EV e ET nfiriuri: lu cumpostu finòlicu rapprisintatu dû nodu dû circu virdi e la diffirenza significativa (valuri P) ntra li trattamenti W + OSM e W + OSS1 comu grannizza dû nodu. CP, N-caffioil-tirusina; CS, N-caffioili-spirmidina; FP, àcitu N-firùlicu estiri-àcitu ùricu; FS, N-firulili-spirmidina; CoP, N', N "-cumarulili-tirusina; DCS, N', N"-dicaffioili-spirmidina; CFS, N', N"-caffioili, firuloili-spirmidina; Liciu barbaru nnô figghiu di lupu; Nick. O-AS, zùccaru O-acili.
Allargamu ultiriurmenti l'analisi di nu singulu ginutipu di Nepenthes attenuatu ê populazziuni naturali, aunni forti canciamenti intraspicìfici ntà li livelli di JA erbivori e li livelli di metabboliti spicifici furu discritti prima nté populazziuni naturali (26). Usa stu nzemi di dati pi cummigghiari 43 girmuplasmi. Sti girmuplasmi su' fatti di 123 speci di chianti di N. pallens. Sti chianti foru pigghiati di simenza arricugghiuti nna diversi habitat nativi nna l'Utah, lu Nevada, l'Arizona e la California (Figura S7), carculamu la divirsità mitabbuloma (cca chiamata liveḍḍu di pupulazzioni) divirsità β) e la spicializzazzioni causata di l'OSM. Coerenti cu studi pricidenti, ossirvamu n'ampia gamma di canciamenti metabbolici longu l'assi Hj e δj, ca innica ca li girmuplasmi hannu diffirenzi significativi ntà plasticità dî sò risposti metabbolici a l'erbivori (Figura S7). Chista urganizzazziuni arriòrda l'osservazziuni pricidenti supra la gamma dinamica dî canciamenti dî JA causati di l'erbivori e mantinìu nu valuri assà jautu ntà na singula populazziuni (26, 36). Usannu JA e JA-Ile pi pruvari la currilazziuni dû livellu cumplissivu ntra Hj e δj, attruvamu ca c'è na currilazziuni positiva significativa ntra JA e l'indici di diversità e spicializzazziuni dû metabbulumu β (Figura S7). Chistu suggirisci ca l'eterogginità indutta di l'erbivori ntà l'induzziuni dî JA rilivata ntò livellu dâ populazziuni pò essiri duvuta ê polimorfismi metabbolici chiavi causati dâ silizziuni di l'insetti erbivori.
Studi pricidenti mustraru ca li tipi di tabbaccu sunnu assà diffirenti ntô tipu e ntâ dipinnenza rilativa dî difisi metabolichi indutti e custitutivi. Si criri ca sti canciamenti ntà trasduzziuni dû signali anti-erbivoru e li capacità di difisa sunnu rigulati dâ prissiuni dâ populazziuni di l'insetti, dû ciclu vitali dî pianti e dî costi di produzziuni di difisa ntà nicchia aunni crisci na certa speci. Studiamu la cunsistenza dû rimudellu dû mitabbulumu dî fogghi induttu di l'erbivori di sei speci di Nicotiana nativi dû Nord America e dû Sud America. Sti speci su' imparintati strittamenti cu lu Nepenthes di l'Amèrica dû Nord, vali a diri Nicolas Bociflo. La, N. nicotinis, Nicotiana n. erba attenuata, Nicotiana tabacum, tabbaccu liniari, tabbaccu (Nicotiana spegazzinii) e tabbaccu a fogghi di tabbaccu (Nicotiana obtusifolia) (Figura 5A) (37). Sei di sti speci, ntra li quali la speci ben carattirizzata N. please, su' chianti annuali dû cladu di pitunia, e l'ottusifolia N. su' chianti pirenni dû cladu soru Trigonophyllae (38). Succissivamenti, l'induzziuni W + W, W + OSM e W + OSS1 furu fatti ntà sti setti speci pi studiari lu riarrangiamentu metabolicu a livellu di speci di l'alimentazziuni di l'insetti.
(A) N'arvuru filugineticu bootstrap basatu ntà prubbabbilità massima [pâ sintisi dâ glutamina nucliari (38)] e la distribbuzziuni giugrafica di setti speci di Nicotiana strittamenti imparintati (culura diversi) (37). (B) Nu graficu di diffusioni di diversità spicializzata pî prufili mitabbolici di setti speci di Nicotiana (939 MS/MS; file di dati S1). Ntò livellu dâ speci, la divirsità metabbuloma è currilata nigativamenti cû gradu di spicializzazziuni. L'analisi dâ currilazziuni a livellu di speci tra la divirsità metabolica e la spicializzazziuni e l'accumulu di JA è mustrata ntà Figura 2. S9. Culuri, tipi diversi; triàngulu, W + OSS1; rittàngulu, W + OSM; (C) Li dinàmichi di Nicotiana JA e JA-Ile sunnu classificati ‘n basi â ampizza di eccitazzioni dû sistema upirativu (ANOVA a dui vie e cunfruntu post-mùrtiplu Tukey HSD, * P <0,05, ** P <0,01 e * ** Pû cunfruntu ri W + OS e W + W, P <0,001). Graficu a scatula di (D) divirsità e (E) spicializzazziuni di ogni speci doppu la simulazziuni di l'erbivori e lu JA mitilicu (MeJA). L'astiriscu ‘nnica a diffirenza significativa ntra W + OS e W + W o lanulina cchiù W (Lan + W) o Lan cchiù MeJA (Lan + MeJa) e cuntrollu Lan (analisi a dui vie dâ varianza, siguita dû cunfrontu mùrtiplu post hoc HSD ri Tukey, *P<0,05, **P<0,01 e).
Usannu lu mètudu dû cluster duppiu, idintificamu 9 mòduli di 939 MS/MS (file di dati S1). La cumpusizziuni di MS/MS ricunfigurata cu trattamenti diversi cancia assà tra moduli diversi tra li speci (Figura S8). Visualizzari Hj (chiamatu ccà γ-divirsità a livellu di speci) e δj rivela ca speci diffirenti s'aggrigunu ntà gruppi assà diffirenti ntò spazziu metabbolicu, aunni la divisiuni a livellu di speci di solitu è ​​cchiù pruminenti di l'eccitazziuni. Cu l'eccizziuni di N. linear e N. obliquus, mustranu n'ampia gamma dinamica d'effetti d'induzziuni (Figura 5B). Ô cuntrariu, li speci comu N. purpurea e N. obtusifolia hannu na risposta metabolica menu ovvia ô trattamentu, ma lu metabbulumu è cchiù diversu. La distribbuzziuni spicifica dâ speci dâ risposta metabolica indutta purtau a na currilazziuni nigativa significativa tra la spicializzazziuni e la divirsità gamma (PCC = -0,46, P = 4,9×10-8). Li canciamenti indutti dô OS nté livelli di JA sunnu currilati positivamenti câ spicializzazziuni dû metabbulumu e nigativamenti câ divirsità gamma metabolica mustrata di ogni speci (Figura 5B e Figura S9). Si va a nutari ca li speci colloquialmenti chiamati speci di "risposta dû signali" ntà Figura 5C, comu li nematodi di Nipinti, lu Nipinti, lu Nipinti acutu e lu Nipinti attenuatu, causaru signa significativi a 30 minuti. Li ricenti epidemii di JA e JA-Ile spicìfici dû sistema upirativu, mentri autri batteri chiamati "signali nun rispunnunu", comu li mulini di Nepenthes, lu pulveri di Nepenthes e N. obtusifolia mustranu sulu l'induzziuni dû bordu dû JA-Ile senza spicificità dû sistema upirativu (Figura 5C). A livellu metabbolicu, comu dittu supra, pî Nepenthes attenuati, li sustanzi ca rispunnunu ô signali mustraru spicificità OS e aumintaru assà δj, riducennu Hj. St'effettu di priming spicificu dû sistema upirativu non fu rilivatu nté speci classificati comu speci non riattivi dû signali (Figura 5, D e E). Li metabboliti spicifici di l'OS sunnu cunnivisi cchiù spissu tra li speci ca rispunnunu ô signali e sti gruppi di signali si raggruppunu cu speci cu risposti signali cchiù debbuli, mentri li speci cu risposti signali cchiù debbuli mustranu menu interdipinnenza (Figura S8). Stu risultatu innica ca l'induzziuni spicifica dû sistema upirativu dî JA e la ricunfigurazziuni spicifica dû sistema upirativu dû metabbulumu a valli sunnu accuppiati ntà lu livellu dâ speci.
Appoi, usamu na pasta di lanulina ca cunteni JA di mitilu (MeJA) pi trattari li chianti pi capiri si sti modi d'accuppiamentu su' ristritti dâ dispunibbilità di JA applicata di JA esugeni, ca sarà nnô cituplasma di chianti. La disitirificazzioni rapida è JA. Attruvamu la stissa tinnenza dû canciamentu graduali dî speci ca rispunnunu ô signali ê speci ca non rispunnunu ô signali causatu dâ furnitura cuntinua di JA (Figura 5, D e E). In brevi, lu trattamentu MeJA riprogrammau fortimenti li metabbulumi dî nematodi liniari, N. obliquus, N. acquatici, N. pallens e N. mikimotoi, purtannu a n'aumentu significativu di δj e na diminuzziuni di Hj. N. purpurea mustrò sulu n'aumentu di δj, ma non di Hj. N. obtusifolia, ca prima fu dimustratu ca accumula liveḋḋi assà vasci di JA, rispunni puru scarsamenti ô trattamentu MeJA in termini di ricunfigurazziuni dû metabbuluma. Sti risultati innicanu câ produzziuni di JA o la trasduzziuni dû signali è fisiuloggicamenti ristritta nté speci ca non rispunnunu ô signali. Pi pruvari st'ipotisi, studiamu li quattru speci (N. pallens, N. mulini, N. rosa e N. microfilla) indutti di W + W, W + OSM e W + OSS1 trascrittuma (39). Coerenti cû schema di rimudellamentu dû metabbuluma, li speci sunnu ben siparati ntà lu spazziu dû trascrittuma, tra cui N. attenuatu mustrau l'RDPI induttu di l'OS cchiù jautu, mentri N. gracilis avìa lu cchiù vasciu (Figura 6A). Com'è gghiè, si scoprìu câ divirsità trascrittuma indutta di N. oblonga era la cchiù vascia tra li quattru speci, ô cuntrariu dâ divirsità metabbunomica cchiù auta di N. oblonga mustrata prima ntà setti speci. Studi pricidenti mustraru ca nu nzemi di geni ligati ê signali di difisa primitivi, inclusi li signali JA, schica la spicificità dî risposti di difisa primitivi indutti di l'elicituri ligati a l'erbivori nté speci di Nicotiana (39). Lu cunfrontu dî vie di signalazziuni JA tra sti quattru speci rivilàu nu schema ntirissanti (Figura 6B). La maggiuranza dî geni ntà stu percorsu, comu AOC, OPR3, ACX e COI1, mustraru livelli rilativamenti auti d'induzziuni ntà sti quattru speci. Com'è gghiè, nu geni chiavi, JAR4, cummirtu lu JA ntà sò forma biuloggicamenti attiva di trascritti accumulati di JA-Ile e lu sò livellu di trascrizziuni è assà vasciu, suprattuttu ntà N. mulini, Nepenthes pieris e N. microphylla. Sparti, sulu la trascrizziuni di n'autru geni AOS non fu truvata ntà N. bifidum. Sti canciamenti ntà l'esprissiuni ginètica ponnu essiri rispunsabbili dî finutipi estremi indutti dâ vascia produzziuni di JA nté speci anergici dû signali e l'induzziuni di N. gracilis.
(A) Analisi dâ tiurìa dâ nfurmazzioni dâ riprugrammazziuni dî primi risposti trascrittivi di quattru speci di tabbaccu strittamenti imparintati campionati 30 minuti doppu l'induzziuni di l'erbivori. Lu RDPI è calculatu cunfruntannu li fogghi indutti di l'OS erbivori cû cuntrollu dî firiti. Li culura innicanu speci diversi e li sìmmuli innicanu mètudi di trattamentu diversi. (B) Analisi di l'esprissiuni ginètica nté vie di signalazziuni JA tra quattru speci. Lu percorsu JA simplificatu è mustratu vicinu ô gràficu dâ scatula. Culura diversi ìnnicanu mètudi di prucissamentu diversi. L'astiriscu ‘nnica ca c'è 'na diffirenza significativa ntra u trattamentu W + OS e u cuntrollu W + W (pû test t dû Student pì diffirenzi ‘n coppia, *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001). OPDA, àcitu 12-ossufitudinòicu; OPC-8: àcitu 0,3-ossu-2(2'(Z)-pintinili)-ciclupintanu-1-uttanòicu.
Ntà l'urtima parti, studiamu comu lu rimudellu spicificu di speci nzetti dû metabbulumu di speci di chianti diversi pò essiri risistenti a l'erbivori. Ricerchi pricidenti enfatizzaru lu gèniri Nicotiana. La sò risistenza ê Ms e ê larvi è assà diffirenti (40). Ccà, studiamu la cunnissiuni ntra chistu modellu e la sò plasticità metabolica. Usannu li quattru speci di tabbaccu supra, e pruvannu la currilazzioni ntra la divirsità e la spicializzazzioni dû metabbuluma causata di l'erbivori e la risistenza di chianti a Ms e Sl, attruvamu la risistenza, la divirsità e la spicializzazzioni ô giniralista Sl Tutti su' currilati pusitivamenti, mentri la currilazzioni ntra la risistenza â divirsità spiciali signuri nun è cu la Fig. S10). Pi quantu riguarda la risistenza a S1, sia lu N. chinensis attenuatu ca lu N. gracilis, ca prima mustraru sia li livelli di trasduzziuni dû signali JA ca la plasticità dû metabbuluma, avìunu risposti assà diffirenti all'induzziuni di l'erbivori, e mustraru puru na risistenza auta simili. Sessu.
Nna l'urtimi sissanta anni, la tiuria dâ difisa di chianti furniu na struttura tiòrica, basata ncapu la quali li ricircatura prividiru un nummaru cunsidirevuli di evuluzzioni e funziuna di mitabboliti spicializzati di chianti. A maggior parti ri chiste tiurìi nun segui a procedura nurmali ri ‘nfirenze forti (41). Propònunu privisioni chiavi (3) ô stissu liveddu ri analisi. Quannu li spirimenti dî privisioni chiavi cunsentunu ri analizzari tiurìi spicìfichi, chistu farà avanzari u campu. Sii sustinutu, ma rifiuta l'autri (42). O rivìersu , a nòva tiurìa fa privisioni a liveddi addiversi ri analisi e agghiùnci 'n novu liveddu ri cunsiderazzioni discrittìvi (42). Com'è gghiè, li du tiurìi pruposti a livellu funziunali, MT e OD, ponnu essiri facilmenti spiegati comu privisioni mpurtanti di canciamenti metabbolici spicializzati causati di l'erbivori: la tiuria OD cridi ca li canciamenti ntà lu "spazziu" metabbolici spicializzatu sunnu assà dirizziunali. La tiuria MT cridi ca sti canciamenti sunnu non dirizziunali e situati a casu ntò spazziu metabbolicu e tennunu a aviri metabboliti cu nu valuri di difisa jautu. Esami pricidenti dî privisioni OD e MT foru tistati usannu nu nzemi strittu di cumposti di "difisa" a priori. Sti provi centrati ncapu li metabbuliti priclùdinu l'abbilità di analizzari l'entità e la traiettoria dâ ricunfigurazzioni dû mitabbulumu duranti l'erbivori, e nun pirmettunu li provi nna na struttura statìstica cuirenti pi richièdiri privisioni chiavi ca ponnu èssiri cunzidirati comu nzemi Quantificari li canciamenti nnô mitabbulumu di chianti. Ccà, usamu a tecnuluggìa ‘nnovativa nnâ metabbulumica basata supra a MS cumputazziunali e fìcimu l'analisi dâ MS di dicunvuluzzioni nnâ valuta ginirali dî discrittura dâ tiurìa dâ ‘nfurmazzioni pì virìficari a distinzioni ntra li dui pruposti a liveddu ri metabbulumìa glubbali. A privisioni chiavi ri chista tiurìa. A tiurìa dâ ‘nformazzioni fu applicata ‘n tanti campi, ‘n particulari ntô cuntestu dâ biudiversità e dâ ricìrca supra u flussu nutritivu (43). Com'è gghiè, pi quantu sapemu, chista è la prima applicazzioni usata pi discrìviri lu spazziu di nfurmazzioni mitabbolici di chianti e arrisòrbiri prubblemi eculoggici lijati a canciamenti mitabbolici timpurani comu risposta a signali ammintali. In particulari, l'abbilità di stu metudu è ntà sò capacità di cunfruntari li schemi dintra e tra li speci di chianti pi esaminari comu l'erbivori s'evulveru di speci diversi a schemi macruevuluzziunari interspeci a livelli diffirenti d'evuluzziuni. Mitabbulismu.
L'analisi dî cumpunenti principali (PCA) cummirtu nu nzemi di dati multivariatu nna nu spazziu di riduzzioni di diminziunalità accussì la tinnenza principali dî dati pò èssiri schicata, quinni di sòlitu veni usata comu tecnica esplurativa pi analizzari lu nzemi di dati, comu lu metabbulumu di dicunvuluzzioni. Com'è gghiè, la riduzziuni dâ diminziunalità pirdirà parti dû cuntinutu d'infurmazziuni ntò nzemi di dati e lu PCA non pò furniri nfurmazziuni quantitativi supra li caratteristichi ca sunnu particularmenti rilivanti pâ tiurìa eculoggica, comu: comu l'erbivori ricunfigurunu la divirsità ntà campi spicializzati (pir esempiu, ricchizza, distribbuzziuni) e abbunnanza) metabboliti? Quali metabboliti sunnu pridituri dû statu induttu di nu certu erbivoru? Dô puntu di vista dâ spicificità, dâ divirsità e di l'inducibbilità, lu cuntinutu nfurmativu dû prufilu metabboliticu spicificu dî fogghi si scumponi e si scopri ca lu manciari di l'erbivori pò attivari nu metabbulismu spicificu. Inaspittatamenti, ossirvamu ca, comu discrivutu ntà l'innicaturi dâ tiuria di l'informazziuni implementati, la situazziuni metabolica ca risurta avi na granni suvrapposizziuni doppu l'attacchi dî du erbivori (lu giniralista alimentatu di notti Sl) e l'esperta dî Solanaceae la signura. L'inizziaturi dû cuniugatu di àciti grassi-amminuacidi (FAC) ntô SO (31). Usannu lu sistema upirativu di l'erbivori pi trattari li firiti di puntura standardizzati, lu trattamentu simulatu di l'erbivori mustrò puru na tinnenza simili. Sta prucidura standardizzata pi simulari la risposta di chianti a l'attacchi di l'erbivori elimina li fattura di cunfusioni causati di canciamenti nnô cumpurtamentu alimintari di l'erbivori, ca purtanu a vari gradi di danni 'n tempi diversi (34). Lu FAC, ca è canusciutu comu la causa principali di l'OSM, arridduci lu JAS e autri risposti urmunali di chianti ntà OSS1, mentri l'OSS1 arridduci cintinara di voti (31). Com'è gghiè, l'OSS1 pruvucau liveḍḍi simili d'accumulu di JA rispettu a l'OSM. Pricidentimenti fu dimustratu câ risposta JA ntà Nepenthes attenuatu è assà sinsibbili a l'OSM, aunni lu FAC pò mantèniri la sò attività puru si è dilujatu 1:1000 cu acqua (44). Pirciò, rispìettu â OSM, sebbeni lu FAC nnâ OSS1 è assái vasciu, è abbastanti pì ‘nduciri n’epidemia ri JA sufficienti. Studi pricidenti mustraru ca li prutiini simili a li purini (45) e l'uligusaccaridi (46) si ponnu usari comu pinzati muliculari pi attivari li risposti di difisa di chianti nna OSS1. Com'è gghiè, nun è ancora chiaru si sti elicituri ntà OSS1 sunnu rispunsabbili di l'accumulu di JA ossirvatu ntà lu studiu attuali.
Puru si ci sunnu picca studi ca discrivunu l'impronti mitabbolichi diffirinziali causati di l'applicazziuni di diversi erbivori o JA o SA esugeni (àcitu salicilicu) (47), nuḋḋu pirturbau la pirturbazziuni spicifica dâ speci erbivora ntà riti di l'erba di chianti e li sò effetti ntà lu sistema metabbolicu spicificu è cumplessivu. nfurmazzioni pirsunali. St'analisi cunfirmò puru ca la cunnissioni dâ riti urmunali nterna cu autri urmuna di chianti autri ca li JA furma la spicificità dâ riurganizzazziuni metabolica causata di l'erbivori. ‘n particulari, rilivàmu ca l'ET causata dâ OSM era assái cchiù granni ri chiḍḍa causata dâ OSS1. Chista modalità è coerenti cu cchiù cuntinutu FAC nnâ OSM, ca è na cunnizzioni nicissària e sufficienti pi attivari nu burst ET (48). Ntô cuntestu dâ ntirazzioni ntra chianti e erbivori, la funzioni di signalazzioni di ET ncapu li dinàmichi mitabboliti spicifici di chianti è ancora sporadica e mira sulu a nu gruppu cumpostu sulu. Sparti, la maggiuranza dî studi usaru l’applicazziuni esugeni di ET o li sò pricursuri o vari inibbituri pi studiari la rigulazziuni di l’ET, ntra cui sti applicazziuni chimichi esugeni prudùcinu tanti effetti latu nun spicìfici. Pi quantu sapemu, stu studiu rapprisenta lu primu esami sistimàticu ncapu larga scala dû rolu di l'ET nna l'usu di l'ET pi pruduciri e pircipiri chianti transgènichi nfiriuri pi cuurdinari li dinàmichi dû metabbuluma di chianti. L'induzziuni ET spicifica di l'erbivori â fini pò modulari la risposta dû metabbulumu. Lu cchiù mpurtanti è la manipulazziuni transgènica dî geni dâ biusintisi ET (ACO) e dâ pircizziuni (ETR1) ca mustraru l’accumulu di finulamidi de novo spicìfici di l’erbivori. Pricidentimenti fu dimustratu ca l'ET pò sintonizzari l'accumulu di nicotina induttu dâ JA rigulannu la N-mitiltransfirasi dâ putrescina (49). Com'è gghiè, d'un puntu di vista miccànicu, nun è chiaru comu l'ET sintuna l'induzziuni dâ finamida. Ortri â funziuni di trasduzziuni dû signali di l'ET, lu flussu metabbolicu pò essiri puru spustatu ntà S-adenosil-1-mitionina pi rigulari l'investimentu ntà l'amidi di poliamminufinolu. La S-adenusil-1-mitionina è ET e ntirmediu cumuni dâ via biusintetica dâ poliamina. Lu meccanismu cu cui lu signali ET règula lu livellu di finulamida àvi bisognu di ultiriuri studi.
Pi tantu tempu, a causa dû granni nummuru di metabboliti spiciali di struttura scanusciuta, l'attinzioni intensa a spicifici catigurìi metabolichi non fu capaci di valutari strittamenti li canciamenti timpurali dâ divirsità metabbolica doppu li ntirazziuni biuloggici. Attualmenti, basatu ncapu l'analisi dâ tiurìa di l'infurmazzioni, lu risultatu principali di l'acquisizziuni dû spettru MS/MS basatu ncapu li metabboliti imparziali è ca l'erbivori ca mancianu o simulanu l'erbivori cuntinuunu a ridduciri la divirsità mitabbolica cumplissiva dû metabbulumu dî fogghi aumintannu ô stissu tempu lu so gradu di spicializzazziuni. St'aumentu timpuraniu dâ spicificità dû metabbuluma causatu di l'erbivori è assuciatu a n'aumentu sinerggisticu dâ spicificità dû trascrittuma. La carattirìstica ca cuntribbuisci cchiù assài a sta spicializzazziuni dû metabbulumu cchiù granni (ca avi nu valuri di Si cchiù jautu) è lu metabbolitu spiciali câ funziuni erbivora caratterizzata pricidentimenti. Chistu modellu è coerenti câ privisioni dâ tiurìa dâ OD, ma la privisioni dâ MT ligata â casualità dâ riprugrammazziuni dû metabbolomu nun è coerenti. Com'è gghiè, sti dati sunnu puru coerenti câ privisioni dû mudellu mistu (megghiu MT; Figura 1B), picchì autri metabboliti non caratterizzati cu funziuni di difisa scanusciuti ponnu ancora seguiri na distribbuzziuni casuali di Si.
Nu schema nutevuli acquisitu ultiriurmenti di sta ricerca è ca dû livellu di micru-evuluzziuni (populazziuni di chianti e tabbaccu singuli) a na scala evulutiva cchiù larga (speci di tabbaccu strittamenti imparintati), livelli diversi d'urganizzazziuni evulutiva sunnu ntà "megghiu difisa". Ci sunnu diffirenzi significativi ntà l'abbilità di l'erbivori. Moore e avutri. (20) e Kessler e Kalske (1) prupuneru innipinnentimenti di cunvirtiri li tri livelli funziunali dâ biudiversità originariamenti distinti di Whittaker (50) ntà li canciamenti timpurali custitutivi e indutti dâ diversità chimica; sti auturi non riassumìru mancu Li pruciduri pâ ricota dî dati metabbolici su larga scala non discrivunu puru comu calculari la divirsità metabbolica di sti dati. Nna stu studiu, l'aggiustamenti minuri â classificazziuni funziunali di Whittaker cunzidiranu la divirsità α-mitabbolica comu la divirsità di spettri MS/MS nna na certa chianta, e la divirsità β-mitabbolica comu lu mitabbulismu intraspicìficu di basi di nu gruppu di populazziuni Spazziu, e la divirsità γ-mitabbolica sarà n'estinsiuni di l'analisi simili.
Lu signali JA è essinziali pi n'ampia gamma di risposti metabolichi di l'erbivori. Com'è gghiè, c'è na mancanza di provi quantitativi rigurusi dû cuntribbutu dâ rigulazziuni intraspicifica dâ biusintisi JA â divirsità metabbolumica e si lu signali JA è nu situ ginirali pâ diversificazziuni metabbolica indutta dô stress ntà na scala macruevulutiva cchiù jauta è ancora elusiva. Ossirvamu ca la natura erbivora di l'erbivoru di Nepenthes pruvoca la spicializzazziuni dû mitabbulu e la variazziuni dâ spicializzazziuni dû mitabbulu ntà populazziuni di speci di Nicotiana e tra li speci di Nicotiana strittamenti imparintati è sistematicamenti currilata positivamenti câ signalazziuni JA. Nortri, quannu lu signali JA è riduttu, la spicificità metabolica indutta di nu singulu ginutipu erbivoru sarà cancillata (Figura 3, C e E). Siccomu li canciamenti dû spettru metabbolicu dî populazziuni di Nepenthes naturalmenti attenuati sunnu principarmenti quantitativi, li canciamenti ntà divirsità β metabbolica e la spicificità ntà st'analisi ponnu essiri assà causati dâ forti eccitazziuni dî catigurìi cumposti ricchi di metabboliti. Sti classi cumposti duminanu na parti dû prufilu dû metabbulumu e portunu a na currilazziuni positiva cchî signali JA.
Siccomu li miccanismi biuchimici dî speci di tabbaccu strittamenti imparintati sunnu assà diversi, li metabboliti sunnu spicificamenti identificati ntà l'aspettu qualitativu, quinni è cchiù analìticu. Lu prucessu dâ tiurìa di l'informazziuni dû profilu metabbolicu acquisitu rivela ca l'induzziuni erbivora aggrava lu compromissu tra la divirsità gamma metabbolica e la spicializzazziuni. Lu signali JA havi nu rolu cintrali nna chistu scanciu. L'aumentu dâ spicializzazziuni dû metabbulu è coerenti câ privisioni principali di l'OD e è currilatu positivamenti cû signali JA, mentri lu signali JA è currilatu nigativamenti câ diversità gamma metabolica. Sti mudeḍḍi ìnnicanu ca la capacità di OD di chianti è ditirminata principalmenti dâ plasticità di JA, sia nna na scala micruevulutiva ca nna na scala evulutiva cchiù larga. Li spirimenti d'applicazziuni esugeni di JA ca eludunu li difetti di biusintisi di JA rivelanu puru ca li speci di tabbaccu imparintati di vicinu si ponnu distinguiri ntà speci ca rispunnunu ô signali e non ca rispunnunu ô signali, propriu comu lu sò modu di JA e la plasticità dû metabbulumi induttu di l'erbivori. Li speci non rispunnunu ô signali non ponnu rispunniri a causa dâ sò incapacità di prudurri JA endòggini e quinni sunnu suggetti a limitazziuni fisiuloggici. Chistu pò essiri causatu di mutazziuni ntà quarchi geni chiavi ntà via di signalazziuni JA (AOS e JAR4 ntà N. crescens) di. Stu risultatu suttalinea ca sti schemi macruevuluzziunari interspeci ponnu essiri spinti principarmenti dî canciamenti ntà pircizziuni e rispunzabbilitati ormonali nterni.
Ortri â ntirazziuni tra chianti e erbivori, l'esplorazziuni dâ divirsità mitabbòlica è currilata a tutti li prugressi tiurici mpurtanti ntà ricerca di l'adattamentu biuloggicu a l'ambienti e l'evuluzziuni di tratti finutipici cumplessi. Cû aumentu dâ quantità di dati acquisiti dî strumenti MS muderni, li provi di l'ipotisi ntà diversità metabolica ora ponnu trascinniri li diffirenzi metabboliti innividuali/catigurìi e fari n'analisi glubbali pi rivelari schemi inaspittati. Ntô prucessu di l'analisi supra larga scala, na metàfura mpurtanti è l'idèa di cuncipiri mappi significativi ca ponnu èssiri usati pi esplurari li dati. Pirciò, nu risultatu mpurtanti dâ cumminazziuni attuali di metabbulumica MS/MS imparziali e tiurìa di l'informazziuni è ca duna na metrica simplici ca pò essiri usata pi custruiri mappi pi sfogliari la divirsità metabolica ntà scali tassunomici diversi. È lu riquisiti di basi di stu mètudu. Lu studiu dâ micru/macro evuluzzioni e l'ecoluggìa dâ cumunità.
A liveḍḍu macru-evulutivu, lu cori dâ tiuria di cu-evuluzzioni chianti-nzetti di Ehrlich e Raven (51) è di prividiri ca la variazzioni dâ divirsità mitabbòlica ntirspeci è la causa dâ diversificazziuni di lignaggi di chianti. Tuttavia, nnî cinquant’anni dâ pubblicazzioni ri chistu travagghiu funnamintali, chista ipòtisi fu raramenti virìficata (52). Chistu è duvutu 'n larga parti ê carattiristichi filuginetichi di carattirìstichi mitabbolici cumparabbili ntra lignaggi di chianti a longa distanza. La rarità pò èssiri usata pi ancorari li mètudi d'anàlisi birsagghiu. Lu flussu di travagghiu attuali MS/MS prucissatu dâ tiuria di l'informazziuni quantifica la sumigghianza strutturali MS/MS dî metabboliti scanusciuti (senza silizziuni pricidenti dî metabboliti) e cummirtu sti MS/MS ntà nu nzemi di MS/MS, quinni ntà lu metabbulismu prufissiunali Sti mudelli macru-evulutivi sunnu cunfruntati ntà scala di classificazziuni. ‘nnicatura statìstici sìmplici. Lu prucessu è simili all'analisi filuginetica, ca pò usari l'allineamentu dâ siquenza pi quantificari la prubabbilità di diversificazziuni o l'evuluzziuni dî carattiri senza privisioni pricidenti.
A livellu biuchimicu, l'ipotisi di screening di Firn e Jones (53) mustra câ divirsità metabolica si manteni a livelli diversi pi furniri matiriali primi pi esercitari l'attività biuloggici dî metabboliti pricidentimenti non currilati o sustituiti. Li mètudi dâ tiurìa di l'informazziuni dugnunu na struttura aunni sti transizziuni evulutivi spicifici dî metabboliti ca si virificanu duranti la spicializzazziuni dî metabboliti ponnu essiri quantificati comu parti dû prucessu di screening evulutivu prupostu: adattamentu biuloggicamenti attivu di spicificità vascia a spicificità jauta Li metabboliti inibbiti di nu certu ambienti.
Tuttu chistu, nne primi jorna dâ biuluggìa muliculari, foru sbiluppati tiurii mpurtanti di difisa di chianti, e li mètudi diduttivi guidati di ipòtisi su' ampiamenti cunzidirati l'unicu menzu di prugressu scintìficu. Chistu è duvutu 'n larga parti ê limitazziuni tecnichi dâ misurazziuni dû metabbulumu interu. Sebbeni li mètudi guidati dâ ipòtisi sunnu particularmenti utili pâ scigghiuta ri avutri miccanìsimi causali, a sò capacità ri fàri prugridìri a nostra cumprensioni dî riti biuchìmichi è cchiù limitata rispìettu â li mètudi computazziunali attualmenti disponìbbili nnâ scienza cuntempurania ca ‘ntinsiva assái dati. Pirciò, li tiurìi ca nun ponnu èssiri privisti sunnu assái oltri lu purtata dî dati disponìbbili, quinni l'ipotètica fòrmula/ciclu di prova dû prugressu ntô campu dâ ricìrca nun pò èssiri cancillata (4). Prividimu ca lu flussu di travagghiu computazziunali dâ metabbulumica introdotta ccà pò riaccidiri l'intiressi ntà li prubblemi ricenti (comu) e finali (picchì) dâ diversità metabbolica e cuntribbuiri a na nova era dâ scienza dî dati tiuriamenti guidata. L'era esaminò n’àutra vota li tiurìi ‘mpurtanti ca ispiraru li ginirazzioni pricidenti.
L'alimentazzioni diretta di l'erbivori si fa allivannu na larva di sicunnu instar o larva Sl nna na singula fogghia di chianta di vasu di culuri chiaru di na singula chianta a ciuritura di rosa, cu 10 riplichi di chianti pi chianta. Li larvi di nzetti foru strinciuti cu pinni, e lu tissutu di fogghi ristanti fu arricugghiutu 24 e 72 uri doppu l'infizzioni e cugghiatu lestu, e li metabboliti foru estratti.
Simulari lu trattamentu di l'erbivori 'n manera assai sincrunizata. Lu mètudu è di usari roti a mutivi di tissutu pi puniri tri fili di spini nna ogni latu dâ nirvatura di tri fogghi cumpletamenti allargati dâ chianta duranti lu stadiu di criscita dâ ghirlanda di tissutu, e appricari subbitu 1:5 Diluted Ms. O usari li jita guanti pi mèttiri S1 wound nnô OS. Arricuogghiri e prucissari na fogghia comu discrittu supra. Usa lu mètudu discrittu prima pi estrarri metabboliti primari e urmuna di chianti (54).
Pi applicazzioni di JA esugeni, li tri fogghi di pizziuli di ognuna di li sei chianti a rosa di ogni speci su' trattati cu 20 μl di pasta di lanulina ca cunteni 150 μg di MeJA (Lan + MeJA), e 20 μl di lanulina cchiù trattamentu di firiti (Lan + la μl2), o usati comu cuntrollu purpurinu. Li fogghi foru arricugghiuti 72 uri doppu lu trattamentu, cugghiuti 'n azzotu liquidu e sarbati a -80°C nzinu a l'usu.
Ntô nostru gruppu di ricerca foru identificati quattru lini transgènichi JA e ET, vali a diri irAOC (36), irCOI1 (55), irACO e sETR1 (48). l'irAOC mustrò fortimenti na diminuzziuni dî livelli di JA e JA-Ile, mentri l'irCOI1 nun era sinsìbbili ê JA. Ô cunfrontu di l'EV, l'accumulu di JA-Ile aumintau. Â stissa manera, l'irACO arridduci la produzziuni di ET e rispettu a l'EV, sETR1, ca è insinsìbbili a l'ET, aumintarà la produzziuni di ET.
Nu spettròmitru laser fotuacùsticu (Sensor Sense ETD-300 sinsuri ET ‘n tempu riali) veni usatu pi fari misurazzioni ET ‘n manera nun nvasiva. Subbitu doppu lu trattamentu, la mità di fogghi fu tagghiata e trasfiruta nna na fiala di vitru sigillata di 4 ml, e lu spazziu pâ testa fu lassatu accumulari nta 5 uri. Duranti la misurazzioni, ogni fiala fu sciacquata cu nu flussu di 2 litri/ura di aria pura pi 8 minuti, ca prima avìa passatu attraversu nu catalizzaturi furnitu di Sensor Sense pi livari CO2 e acqua.
Li dati dî micruarray foru pubbricati 'n principiu nnô (35) e sarbati nnô Bancu di dati cumpletu di l'esprissiuni ginètica dû Centru Nazziunali di Nfurmazzioni Biutecnulòggichi (NCBI) (nùmmaru d'accissiuni GSE30287). Li dati currispunnenti ê fogghi causati dû trattamentu W + OSM e dû cuntrollu nun danneggiatu foru estratti pi stu studiu. La ntinsità grezza è log2. Prima di l'anàlisi statìstica, la linia di basi fu cummirtuta e nurmalizzata ô so 75° pircintuali usannu lu pacchettu software R.
Li dati urigginali di siquinziamentu di l'RNA (RNA-seq) dâ speci di Nicotiana furu truvati di l'Archivi di Lettura Curta dû NCBI (SRA), lu nùmmaru dû pruggettu è PRJNA301787, ca fu ripurtatu di Zhou et al. (39) e prucidiri comu discrittu nnô (56). Li dati grezzi prucissati di W + W, W + OSM e W + OSS1 ca currispunnunu ê speci di Nicotiana foru scigghiuti pi l'analisi nna stu studiu e prucissati ntà manera siquenti: Prima, li litturi grezzi di RNA-seq foru cummirtuti ntà furmatu FASTQ. HISAT2 cummirti FASTQ 'n SAM, e SAMtools cummirti li file SAM 'n file BAM urdinati. StringTie veni usatu pi calculari l'esprissiuni ginètica e lu sò mètudu d'esprissiuni è ca ci sunnu frammenti pi mill'framenti di basi pi miliuni di frammenti di trascrizziuni siquinziati.
La culonna cromatugràfica Acclaim (150 mm x 2,1 mm; grannizza dî particeḍḍi 2,2 μm) usata nta l’anàlisi e la culonna di prutizzioni di 4 mm x 4 mm su’ fatti dû stissu matiriali. Lu gradienti binariu siquenti è usatu nnô sistema di cromatugrafìa liquida a granni prissioni (UHPLC) Dionex UltiMate 3000: di 0 a 0,5 minuti, isucràtica 90% A [acqua dijunizzata, 0,1% (v/v) di acitunitrilu (v/v) di acitunitrilu e 0,05% di àcitu B 0,05% àcitu fòrmicu); 0,5 a 23,5 minuti, la fasi dû gradienti è rispittivamenti dû 10% A e dû 90% B; 23,5 a 25 minuti, isucràticu 10% A e 90% B. Lu purtata è di 400μl/min. Pi tutti l’anàlisi MS, iniettari l’eluenti dâ culonna nta n’analizzaturi quadrupoli e tempu di volu (qTOF) dutatu di na funti di elettruspruzzu ca funziona ‘n modalità di junizzazzioni pusitiva (tinzioni capillari, 4500 V; uscita capillari 130 V; timpiratura di flussu di asciugatura 200°C;0°C).
Eseguiri n'analisi dî frammenti MS/MS (di seguitu chiamati MS/MS) ca è irrilevanti o indistinguibbili dî dati pi ottèniri nfurmazziuni strutturali supra lu prufilu metabbolicu cumplessivu rilivàbbili. Lu cuncettu dû mètudu MS/MS indiscriminatu si basa ncapu lu fattu ca lu quadrupoli àvi na finestra d’isulamentu di massa assai granni [pirciò, cunzidira tutti li signali dû rapportu massa-carica (m/z) comu frammenti]. Pi chistu mutivu, siccomu lu strumentu Impact II nun fu capaci di criari n’inclinazzioni CE, foru fatti diversi analisi nnipinnenti usannu valura aumintati di l’enirgìa di cullisiuni di dissociazzioni indutta dâ cullisiuni (CE). ‘n brevi, apprìma analizzari u campioni cû junizzazzioni UHPLC-elettruspray/qTOF-MS usannu modalità ri spettrumitrìa ri massa sìngula (cunnizzioni ri frammentazzioni vascia giniràta dâ frammentazzioni ‘n funti), scansionannu ri m/z 50 a 1500 a 'na friquenza ri ripitizzioni ri 5 Hz. Usa lu nitrogginu comu gas di cullisiuni pi l’anàlisi MS/MS e fari misurazzioni nnipinnenti a li quattru vurtaggi di dissuciazzioni nnùtti dâ cullisiuni: 20, 30, 40 e 50 eV. Ntô prucessu di misurazzioni, lu quadrupulu àvi la finestra d’isulamentu di massa cchiù granni, di m/z 50 a 1500. Quannu lu spirimentu dû corpu davanti m/z e larghizza d’isulamentu è misa a 200, l’intervallu di massa veni attivatu autumaticamenti dû prugramma upirativu dû strumentu e 0 Da. Scansiona li frammenti di massa comu nnâ modalità di massa sìngula. Usa lu furmatu di sodiu (50 ml di isuprupanolu, 200 μl di àcitu fòrmicu e 1 ml di suluzzioni acquea di NaOH 1M) pâ calibrazzioni di massa. Usannu l’arguritmu di calibrazzioni a granni pricisiuni di Bruker, lu file di dati veni calibratu doppu ca si fa girari lu spettru mediu nna un certu pirìudu di tempu. Usa la funzioni di spurtazzioni dû prugramma Analisi dî Dati v4.0 (Brook Dalton, Brema, Girmania) pi cummirtiri li file di dati grezzi nnô furmatu NetCDF. Lu nzemi di dati MS/MS fu sarbatu ntô databbasi mitabbulumica apertu MetaboLights (www.ebi.ac.uk) cû nùmmaru d'accissioni. MTBLS1471.
Lu muntaggiu MS/MS si po rializzari cu l’anàlisi di currilazzioni ntra signali di qualità MS1 e MS/MS pi enirgìa di cullisiuni vascia e auta e règuli mprimintati di novu. Lu script R veni usatu pi rializzari l'anàlisi di currilazzioni dâ distribbuzzioni dû pricursuri dû pruduttu, e lu script C# (pipeline di muntaggiu-MS-MS-indiscriminanti) veni usatu pi mprimintari li règuli.
Pî ridùciri li sbagghi falsi pusitivi causati dû scrùsciu di funnu e la fausa currilazzioni causata dû rilevamentu di certi carattirìstichi m/z sulu nta picca campioni, usamu la funzioni “piccu chini” dû pacchettu R XCMS (pâ currizzioni dû scrùsciu di funnu) S’avissi a usari pi scanciari lu “peak” Quannu si usa la funzioni di piccu di riempimentu, cci su' ancora assai valura di ntinsità di "0′′ nnô nzemi di dati ca nfruenzanu lu càrculu di currilazzioni. Poi, cunfruntamu li risurtati di prucidura di dati uttinuti quannu si usa la funzioni di piccu di riempimentu e quannu la funzioni di piccu di riempimentu nun veni usata, e carculamu lu valuri di scrùsciu di funnu currettu ncapu a chisti valura di ntinsità cû valuri di funnu calculatu Cunzidiramu sulu li carattirìstichi ca la ntinsità supirava tri voti lu valuri di funnu e li cunzidiràvamu comu “veri vetti”. Pî càrculi PCC, si cunzidiranu sulu li signali m/z dû pricursuri dû campioni (MS1) e li nzemi di dati di frammenti cu armenu ottu picchi veri.
Si l’intinsità dâ carattirìstica ri qualitàti pricursuri nnô ‘nteru campioni è significativamenti currilata â ‘ntinsità ridutta dû stissu carattarìstica ri qualitàti ca è suggetta a enirgìa ri cullisiuni vascia o àuta, e a carattarìstica nun è etichettata comu nu piccu isòtupu dâ CAMERA, pò èssiri ultiriurmenti difinìta. Poi, carculannu tutti li possibbili coppi pricursuri-pruduttu entru 3 s (la finestra di tempu di ritenzioni stimata pâ ritenzioni di piccu), si fa l'analisi di currilazzioni. Sulu quannu lu valuri m/z è cchiù vasciu dû valuri dû pricursuri e la frammentazzioni MS/MS si virifica nnâ stissa pusizzioni dû campioni ntô nzemi di dati dû pricursuri di unni diriva, è cunzidiratu nu frammentu.
‘n basi a chisti du’ règuli sìmplici, escludiamu li frammenti spicificati cu valura m/z cchiù granni dû m/z dû pricursuri idintificatu, e ‘n basi â pusizzioni dû campioni unni cumpari u pricursuri e u frammentu spicificatu. È macari pussìbbili scègghiri li carattirìstichi di qualità ginirati di tanti frammenti di funti ginirati nnâ modalità MS1 comu pricursuri cannidati, ginirannu accussì cumposti MS/MS ridunnanti. Pî ridduciri sta ridunanza di dati, si la sumigghianza NDP dî spettri supira lu 0,6, e appartèninu ô "gruppu pc" dû cromatogramma annotatu di CAMERA, li juncemu. Â fini, juncemu tutti e quattru li risurtati CE assuciati ô pricursuri e li frammenti nnô spettru cumpostu dicunvulutu finali scegghiennu lu piccu di ntinsità cchiù auta ntra tutti li piccu cannidati cû stissu valuri m/z a enirgìi di cullisiuni diversi. Li passaggi di prucissamentu succissivi si basanu ncapu lu cuncettu di spettru cumpostu e tèninu cuntu dî diversi cunnizzioni CE nicissari pi massimizzari la prubbabbilità di frammentazzioni, picchì certi frammenti ponnu èssiri rilivati ​​sulu cu na certa enirgìa di cullisiuni.
Lu RDPI (30) fu usatu pi calculari l'inducibbilità dû profilu metabolicu. La divirsità dû spettru metabbolicu (indici Hj) veni di l'abbunnanza di pricursuri MS/MS usannu l'intrupìa di Shannon dâ distribbuzziuni dâ friquenza MS/MS usannu l'equazziuni discrivuta di Martínez et al. (8). Hj = -∑i = 1mPijlog2(Pij) unni Pij currispunni â friquenza rilativa dû i-èsimu MS/MS nnô j-èsimu campioni (j = 1, 2,..., m) (i = 1, 2, ..., m) t).
A spicificità metabòlica (indici Si) è definita comu l'identità ri esprissioni ri 'na certa MS/MS ‘n relazzioni â friquenza ntra li campioni ca sunnu cunzidiràti. La spicificità MS/MS è calculata comu Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi)
Usa la fòrmula siguenti pi misurari l'indici δj spicìficu dû metabbulumu di ogni campioni j e la media dâ spicificità MS/MS δj = ∑i = 1mPijSi
Li spettri MS/MS su’ alliniati ‘n coppi e a sumigghianza è calculata ‘n basi â li du’ punteggi. Prima, usannu lu NDP standard (canusciutu puru comu mètudu di currilazzioni cosinu), usa l'equazzioni appressu pi puntuari la sumigghianza dû sigmentu ntra spettri NDP = (∑iS1 e S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2 unni S1 e S2 comu spettru currispunnentimenti, e iWS1,1 i rapprisenta lu pisu basatu ncapu la ntinsità di piccu ca la diffirenza dû i-simu piccu cumuni ntra li du’ spettri è cchiù picca di 0,01 Da. Lu pisu è carculatu comu si vidi appressu: W = [ntinsità màssima] m [qualità] n, m = 0,5, n = 2, comu suggirìu di MassBank.
Fu implementatu nu secunnu mètudu ri puntuazziuni, ca cumprinnìa l'analisi dû NL cunnivìsu ntra MS/MS. A chistu fini, usamu li 52 listi NL spissu scuntrati duranti lu prucessu di frammentazziuni MS 'n tandem, e lu NL cchiù spicìficu (file di dati S1) ca fu annotatu prima pò spettru MS/MS dî metabboliti sicunnari dâ speci di Nepenthes 'ndibbulìta ( 9, 26 ). Criari un vitturi binariu di 1 e 0 pi ogni MS/MS, currispunnenti rispittivamenti â currenti e â nun esistenti di quarchi NL. Basatu ncapu la sumigghianza di distanza euclidea, lu punteggiu di sumigghianza NL veni carculatu pi ogni para di vittura NL binari.
Pi fari nu raggruppamentu duppiu, usamu lu pacchettu R DiffCoEx, ca si basa ncapu n'estinsiuni di l'analisi dâ co-esprissiuni ginètica pisata (WGCNA). Usannu li matrici di puntuazziuni NDP e NL dî spettri MS/MS, usamu DiffCoEx pi carculari la matrici di currilazzioni cumparativa. Lu raggruppamentu binariu si fa mpustannu lu paràmitru "cutreeDynamic" a mètudu = "ibbridi", autizza tagghiata = 0,9999, spartuta prufunna = T e grannizza minima = 10. Lu còdici surgenti R di DiffCoEx fu scaricatu di n'autru file 1 di Tesson et al. (57); Lu pacchettu prugrammàticu R WGCNA nicissariu si po truvari nne WGCNA.
Pî fari l'anàlisi dâ riti muliculari MS/MS, carculamu la cunnittivitati spettrali accuppiata basata ncapu a tipi di sumigghianza NDP e NL, e usamu lu prugramma Cytoscape pi visualizzari la topuluggìa dâ riti usannu lu layout urganicu nna l'applicazzioni di l'estensioni di l'arguritmu di layout CyFilescape yFiles.
Usa la virsiuni R 3.0.1 pi fari n'anàlisi statìstica ncapu li dati. Lu significatu statisticu fu valutatu usannu l'analisi a dui vie dâ varianza (ANOVA), assicutatu dô test post-hoc dâ diffirenza onestamenti significativa (HSD) di Tukey. Pì analizzari a differenza ntra u trattamentu erbivoru e u cuntrollu, a distribbuzzioni a dui cudi dî dui gruppi ri campioni câ stissa varianza venni analizzata usannu u test t ri Student.
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