La urdinazziuni dî pruteini ntà via secretoria è essinziali pi mantèniri la cumpartimentazziuni cellulari e l'omustasi. Ortri â scelta mediata dâ scoccia, lu rolu dî lipidi ntà scelta dâ cinesina ntò prucessu di trasportu secretoriu è na dumanna di basi di longa data ca non fu ancora risposta. Ccà, famu n'immagginazziuni 3D simultania multicolori a risuluzziuni auta 'n tempu riali pi pruvari in vivo ca li prutiini glicosilfosfatidilinositolu sintitizzati di novu cu frazziuni di lipidi di ciramidi assà longhi sunnu raggruppati e classificati ntà enduplasmi spicializzati. Sparti, mustramu câ lunghizza dâ catina dâ ciramida ntà mimbrana dû riticulu enduplasmaticu è funnamintali pi sta silittività di urdinamentu. Lu nostru studiu duna la prima prova diretta in vivo pi classificari li carichi pruteici basati ntà lunghizza dâ catina lipidica ntà siti d'esportazziuni silittivi ntà via sicretoria.
Ntà li celluli eucariuti, li proteini sintitizzati ntà lu riticulum enduplasmaticu (ER) poi sunnu urdinati duranti lu trasportu attraversu lu percorsu sicretoriu pi èssiri cunsignati â sò distinazziuni cellulari apprupriata (1). Ortri â scelta mediata dô rivestimentu, si pinsava pi tantu tempu ca certi lipidi ponnu puru serviri comu punti di uscita silittivi raggruppannuli ntà spicifici dumini di mimbrani ca pruteini spicifici (2-5). Com'è gghiè, ci sunnu ancora na mancanza di provi diretti in vivo pi pruvari chistu pussibbili meccanismu basatu ncapu li lipidi. Pî arrisòrbiri chistu prubblema di basi, studiamu ntô lievitu comu li proteini ancorati ô glicosilfosfatidilinositolu (GPI) (GPI-AP) vennu esportati diffirentimenti dâ ER. Li GPI-AP sunnu na varietà di pruteini dâ supirfici cellulari ligati ê lipidi ( 6, 7 ). Lu GPI-AP è na prutiina secreta attaccata ê fogghi esterni dâ mimbrana plasmatica attraversu la parti glicolipidica (ancora GPI). Accittunu l'ancori GPI comu mudifichi post-traslazziunali cunservatrici ntò lumen ER (8). Doppu l'attaccu, lu GPI-AP passa attraversu l'apparatu Golgi (5, 9) di l'ER â mimbrana plasmatica. La prisenza di l'ancori GPI fa traspurtari lu GPI-AP siparatamenti dî pruteini secreti transmimbrani (inclusi autri pruteini dâ mimbrana plasmatica) longu lu percorsu secretoriu (5, 9, 10). Ntà li celluli dû lievitu, li GPI-AP sunnu siparati di l'autri pruteini secreti ntà lu riticulum enduplasmaticu e poi mmallati ntà vesciculi unichi avvolti dû cumplessu pruteicu dû rivestimentu II (COPII) (6, 7). Li ditirminanti di stu prucessu di classificazziuni ntà lu prucessu d'esportazziuni ER non sunnu chiari, ma si pensa ca stu miccanismu pò richièdiri lipidi, spicialmenti lu rimudellu strutturali dâ purziuni lipidica di l'ancora GPI (5, 8). Ntà lu lievitu, lu rimudellu lipidicu dû GPI accumincia subbitu doppu ca lu GPI s'attacca e ntà tanti casi, fa ligari la ciramida a l'acidu grassu saturatu a catina longa di 26 carboni (C26:0) (11, 12). La ciramida C26 è la ciramida principali prudutta dî cèlluli dû lievitu nzinu a ora. È sintitizzatu ntà l'ER e la maggiuranza è esportata ntà l'apparatu Golgi attraversu li vesciculi COPII (13). L'esportazziuni ER di GPI-AP richiedi ntò spicìficu na sìntisi di ciramida cuntinua (14, 15), e ô cuntrariu, la cunvirsiuni dâ ciramida ntà ciramida di inositolu fusfatu (IPC) ntà l'apparatu di Golgi dipenni dâ sintisi di l'ancora GPI (16). Li studi biufisici cu mimbrani artificiali mustraru ca li ciramidi a catina acili assà longa ponnu unirisi pi furmari dumini ordinati cu prupità fisichi unichi (17, 18). Sti dati purtaru all'ipotisi ca la ciramida C26 e lu GPI-AP câ ciramida C26 usunu li sò prupità fisichi pi unirisi ntà riggiuni ordinati o riggiuni ntà l'ambienti lipidicu dâ mimbrana ER rilativamenti disordinatu. È cumpostu principalmenti di glicirulipidi curti e insaturi (C16:1 e C18:1) (19, 20). Sti riggiuni sunnu cuncintrati silittivamenti ntà spicifici siti di uscita ER (ERES), aunni la ciramida e lu GPI-AP basatu ntà ciramida ponnu essiri co-traspurtati ô Golgi ntà stissa vescicula COPII didicata (5).
Nna stu studiu, avemu tistatu direttamenti stu miccanismu basatu ncapu li lipidi usannu la micruscopia di mmàggini cunfucali a super-risuluzzioni 'n tempu riali (SCLIM), ca è na tecnica di micruscopia d'avanguardia ca po ossirvari ô stissu tempu prutiini marcati fluoriscentimenti. (21, 22).
Applicamu pâ prima vota la tecnuluggìa SCLIM pi difiniri comu lu GPI-AP nurmali cû gruppu ciramidi C26 fu vagliatu dî prutiini secreti transmimbrani doppu ca lassau l'ER ntà S. cerevisiae. Pî cuntrullari la classificazziuni di l'ER, usamu nu sistema ginèticu ca pò visualizzari direttamenti lu caricu sintitizzatu di novu ca trasi ntà l'ERES in vivo (7, 23). Comu càrricu, scigghiemu lu GPI-AP Gas1 basatu ncapu la ciramida C26 marcatu cu na prutiina fluoriscenti virdi (GFP) e la prutiina siccirata transmimbrana Mid2 marcata cu na prutiina fluoriscenti quasi nfrarussa (iRFP), ca miranu tutti dui â mimbrana plasmatica (24-26). Ntô mutanti sinsìbbili â timpiratura sec31-1, chisti du’ càrrichi sunnu espressi sutta nu promoturi inducibbili ô galattosiu e nu marcaturi ERES custitutivu. A timpiraturi estremi (37°C), picchì la mutazziuni sec31-1 nfruenza la funziuni dû cumpunenti dû rivestimentu COPII Sec31 pi inibiri la girminazziuni COPII e l'esportazziuni ER, lu caricu appena sintitizzatu s'accumula ntà l'ER (23). Doppu ca si rinfriscàu a na timpiratura vascia (24°C), li celluli mutanti sec31-1 si ricupiraru di l'aria sicretoria e lu novu caricu sinteticu accumulatu accuminciau a essiri espurtatu di l'ER. La visualizzazziuni CLIM mustrò ca la maggiuranza dî Gas1-GFP e Mid2-iRFP appena sintitizzati s'accumularu ancora ntà l'ER dî celluli mutanti sec31-1 doppu l'incubazziuni a 37°C e poi rilassati a 24°C pi 5 minuti (Figura 1). Siccomu lu Mid2-iRFP è distribbuitu ntà tutta la mimbrana ER e lu Gas1-GFP è cuncintratu e arricugghiutu ntà l'aria discontinua dâ mimbrana ER, la sò distribbuzziuni è cumplitamenti diversa (Figura 1, A a C e Movie S1). Sparti, comu mustratu ntâ Figura 1D, lu gruppu Gas1-GFP nun àvi Mid2-iRFP. Sti risultati innicanu ca li proteini GPI-AP e transmimbrani furu siparati ntà riggiuni diffirenti dâ mimbrana ER prima. Lu gruppu Gas1-GFP è vicinu a nu spicìficu ERES marcatu câ prutiina dû rivestimentu COPII di mCherry Sec13 (Figura 1, E e F, e film S1) (23).
Li cèlluli sec31-1 esprimunu li siccirazziuni indutti dû galattosiu, na ciramida a catina acili longa (C26) GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, virdi) e la prutiina transmimbrana Mid2-iRFP (TMP, blu) e chista marcatura ERES custruttiva pi Sec13-mCherry, 30) minuti, spustati a 24°C e mmàgginati di SCLIM 5 minuti doppu. (A a C) mustra n’immaggini 2D rapprisintanti junciuta o sìngula di un chianu (A), n’immaggini di prujizzioni 2D di 10 sizzioni z (B) o n’immaggini di l’emisferu di cèlluli 3D di cargu e marcatura ERES (C). Barra di scala 1μm (A e B). L’unità di scala è 0,551 μm (C). Lu Gas1-GFP fu truvatu ntà riggiuni o gruppi ER discriti, mentri Mid2-iRFP fu truvatu e distribbuitu ntà tutta la mimbrana ER (C). (D) Lu gràficu mustra la ntinsità rilativa di fluuriscenza di Gas1-GFP e Mid2-iRFP ntô gruppu Gas1-GFP longu la linia dâ frèccia janca (a manu manca). AU, unità arbitraria. (E e F) rapprisèntanu l'immaggini 3D ca cummina li bèni e lu marchiu ERES. Li gruppi Gas1-GFP foru rilivati ​​vicinu ô spicìficu ERES. L’unità di scala è 0,551 μm. (F) La frèccia sòlida janca signa lu gruppu Gas1-GFP assuciatu a l'ERES. Li pannelli ‘n menzu e a dritta mùstranu l’immaggini 3D ngrannita e na vista rutata dû cluster Gas1-GFP scigghiutu.
La stritta rilazziuni spazziali tra lu gruppu Gas1-GFP e nu spicificu ERES innica ca Gas1-GFP pò trasiri ntà l'ERES silittiva, ca è diversa dâ silittività usata di Mid2-iRFP pi lassari l'ER. Pì affruntari chista possibbilità, quantificàmu u rapportu ERES pì sulu unu o dui bèni (Figura 2, A a C). Scuprìamu ca a maggior parti dî ERES (70%) cunteni sulu nu tipu ri càrricu. L'immaggini cchiù vascia dâ Figura 2C mustra du' esempi tipici di ERES cu sulu Gas1-GFP (Figura 1) o sulu Mid2-iRFP (Figura 2). Ô cuntrariu, circa lu 20% di l'ERES cunteni dui carichi ca si suvrapponnu ntâ stissa aria. Si scoprìu ca arcuni ERES (10%) cuntinìanu dui tipi di càrricu, ma èranu isulati nta àrii chiaramenti diversi. Pirciò, st'analisi statìstica mustra ca doppu ca l'ER è espurtatu, lu GPI-AP Gas1-GFP e lu càrricu transmimbranu Mid2-iRFP sunnu spartuti ntà ERES diversi (Figura 2D). St'efficienza di urdinamentu è assà coerenti cu l'analisi biuchimica pricidenti (6) e la ditirminazzioni morfulòggica (7). Si pò macari osservari lu cumpurtamentu dû càrricu ‘n quarantena ca trasi nnâ ERES (Figura 2E e Film S2). La figura 2E mustra ca sulu na parti nica di Gas1-GFP (panneḍḍu 3) o Mid2-iRFP (panneḍḍu 4) trasi ntà l'ERES di nu latu e è cunfinata ntà n'aria discrita. Lu panneḍḍu 5 dâ Figura 2E mustra ca Gas1-GFP e Mid2-iRFP certi voti s'attrovunu ntà li stissi ERES, ma trasunu di lati diversi e sunnu cuncintrati ntà riggiuni siparati ca ponnu rapprisintari vesciculi COPII diversi. Cunfirmamu puru ca la siparazziuni ossirvata e la classificazziuni dû GPI-AP Gas1 basatu ncapu la ciramida C26 comu ERES silittiva è spicifica picchì n'autru caricu di siccirizziuni transmimbrana, la prutiina dâ mimbrana plasmatica marcata cû GFP Axl2 (27), ca mustra nu cumportamentu simili a Mid2-iRFP. (Immagini S1 e Film S3). L'Axl2-GFP appena sintitizzatu è distribbuitu attraversu la mimbrana ER comu Mid2-iRFP (Figura S1, A e B), e è co-lucalizzatu cu Mid2-iRFP ntà maggiuranza di l'ERES (Figura S1, B nzinu a D). Li pannelli 1 e 2 dâ Figura 1. S1C mustra du' esempi tipici di ERES unni du' carichi transmimbrani si suvrapponnu. Nnî chisti casi, ‘ntrammi i bèni tràsinu nzèmi nnô ERES (Figura S1E, Pannellu 3 e Film S3).
Li cèlluli sec31-1 ca esprimunu siccirazziuni inducibbili dû galattosiu, Gas1-GFP (GPI-AP, virdi) e Mid2-iRFP (TMP, blu) e marcatura ERES custitutiva Sec13-mCherry (ERES, magenta) furu misi a 37 Doppu l'incubazzioni a °C nzinu a 30 minuti. bloccu, e mmàggini cu SCLIM doppu 20 minuti. (A a C) Mmàggini di prujizzioni 2D rapprisintanti (A; barra di scala, 1μm) o mmàggini di l’emisferu di cèlluli 3D (B e C; unità di scala, 0,456μm) dû càrricu e 10 sizzioni z signati di ERES. Lu panneḍḍu cchiù vasciu ‘n (B) e chiḍḍu ‘n (C) mustranu ‘mmaggini prucissati pì mustrari sulu li bèni prisenti ‘n ERES (magenta) [Gas1-GFP (grigiu) e Mid2-iRFP (blu chiaru)]. (C) Frèccia aperta: ERES trasporta sulu nu pezzu di càrricu (1 a 4). Frèccia grigia: l'ERES cunteni càrrichi sigrigati (5). Frèccia sòlida janca: ERES ca cunteni càrrichi co-lucalizzati. Sutta: lu sìngulu ERES scigghiutu cunteni sulu Gas1-GFP (1) o Mid2-iRFP (2). Barra di scala, 100 nm. (D) Quantificazzioni dû fotumicrugrafu discrittu nnâ (C). La pircintuali media di ERES ca cunteni sulu nu càrricu (Gas1-GFP o Mid2-iRFP), càrricu sigrigatu e càrricu suvrappostu. Ntâ tri spirimenti ‘nnipinnenti, n=432 nnî 54 cèlluli. Barra d'erruri = SD. Test t nun accuppiatu a du’ cudi. *** P = 0,0002. (E) Immaggini 3D di ERES scigghiuti di carichi ‘n quarantena signati cu (C). Gas1-GFP (virdi) (3) o Mid2-iRFP (blu) (4) trasi ntà l'ERES (magenta) di nu latu e è ristrittu a n'aria nica dintra l'ERES. A voti, tutti dui li tipi di càrricu trasunu ntô stissu ERES (5) dô stissu latu e sunu cunfinati nta n'aria isulata rintra l'ERES. Barra di scala, 100 nm.
Successivamenti, virìficamu n'ipotisi ca la ciramida a catina acili longa (C26) prisenti ntà mimbrana ER spinci lu raggruppamentu spicìficu e l'urdinamentu di Gas1 ntà ERES silittiva. A chistu puntu, usamu nu ceppu di lievitu modificatu GhLag1, unni li du' sintasi di ciramidi endòggini Lag1 e Lac1 foru scanciati cu GhLag1 (l'omòlugu Lag1 dû cuttuni), purtannu a nu ceppu di lievitu cu nu ceppu di ciramida di mimbrana cillulari cchiù curtu dû tipu sarvaggiu (Figura 3A) (2). L'analisi dâ spettrumetria di massa (MS) mustrò ca nne ceppi di tipu sarvaggiu, lu 95% dâ ciramida totali è na ciramida a catina assà longa (C26), mentri ntà GhLag1, l'85% dâ ciramida è assà longa (C18 e C16). ), sulu lu 2% dâ ciramida è ciramida a catina assai longa (C26). Puru si li ciramidi C18 e C16 sunnu li ciramidi principali truvati ntà mimbrana GhLag1 nzinu a ora, l'analisi MS cunfirmò puru ca l'ancora GPI di Gas1-GFP esprissu ntà lu ceppu GhLag1 cunteni ciramidi C26, ca è paragunabbili ê lipidi di tipu sarvaggiu. La qualità è la stissa (Figg. 3A) (26). Pirciò, chistu signìfica ca l'enzima ca rimudella la ciramida Cwh43 è assà silittiva pâ ciramida C26, comu mustratu ntà Figura 26, ncorpura prifirinziarmenti l'ancora GPI di na quantità nica di ciramida C26 ntò ceppu GhLag1. S2 (29). Com'è gghiè, la mimbrana cellulari di GhLag1 cunteni sulu ciramida C18-C16, mentri Gas1-GFP avi ancora ciramida C26. Stu fattu renni stu ceppu nu strumentu idiali pi arrisòrbiri spicificamenti lu prubblema dâ lunghizza dâ catina acili dâ ciramida di mimbrana ntà l'ER. Lu rolu iputèticu dâ classi e dû urdinamentu. Poi, prima studiamu l'abbilità dû C26 Gas1-GFP d'accumularisi ntà gruppi ntà GhLag1 cu n'alleli mutanti sinsibbili â timpiratura di sec31-1 attraversu la micruscopia a fluuriscenza cumminziunali, aunni esisti sulu la catina longa (C18-C16) ntà mimbrana ER ciramida (Figg. 3). Ossirvamu ca ntà sec31-1, la maggiuranza dû Gas1-GFP era cuncintratu ntà gruppi, mentri Gas1-GFP ntà sec31-1 GhLag1 cu na mimbrana ER di ciramida longa (C18-C16) principalmenti non era raggruppatu e distribbuitu ntà tutta la mimbrana ER. Pi èssiri pricisi, picchì lu raggruppamentu basatu ncapu la ciramida C26 è strittamenti currilatu a spicìfici ERES (Figura 1), appoi studiamu si chistu prucessu pò coinvolgiri puru la funziuni dû miccanismu di prutiini d'esportazziuni ER. Lu GPI-AP usa nu sistema spiciali COPII pi l'esportazziuni ER, ca è attivamenti rigulatu dâ rimudellazziuni strutturali di Ted1 dâ purziuni glicanica di l'ancora GPI (30, 31). Lu GPI-glicanu ricumminanti è poi arricanusciutu dû cumplessu p24 dû ricipituri di càrricu transmimbranu, ca ô cuntrariu arricluta silittivamenti Lst1, ca è n'isuforma spicifica dâ sutunità di ligami dû càrricu COPII principali Sec24, furmannu na vesiculi COPII ricca di GPI-AP (33). Pirciò, custruemu nu mutanti duppiu ca cumminau la cancillazziuni di sti proteini sìnguli (lu cumpunenti cumplessu p24 Emp24, l'enzima ca rimudella lu GPI-glicanu Ted1 e la sutunità COPII spicifica Lst1) cû ceppu mutanti sec31-1 e li studiamu È pussibbili furmari Gasster GFP1-c3). Ossirvamu ca ntà sec31-1emp24Δ e sec31-1ted1Δ, lu Gas1-GFP è principalmenti non raggruppatu e distribbuitu ntà tutta la mimbrana ER, comu vitti prima ntà sec31-1 GhLag1, mentri ntà sec31-1lst1Δ, lu Gas1-GFP1 comu sec3. Sti risultati innicanu ca ortri â prisenza dâ ciramida C26 ntà mimbrana ER, lu raggruppamentu di Gas1-GFP avi puru bisognu di liàrisi ô cumplessu p24 e non richiedi n'assunziuni Lst1 spicificu. Poi, espluramu la pussibbilità câ lunghizza dâ catina dâ ciramida ntà mimbrana ER pò rigulari lu ligami di Gas1-GFP a p24. Com'è gghiè, attruvamu câ prisenza dâ ciramida C18-C16 ntà mimbrana non nfruenza li GPI-glicani ricostruiti dû cumplessu p24 (Figuri S3 e S4, A e B) o lu ligami ô GPI-AP e l'esportazzioni di GPI-AP. abbilità. Assumiri lu suttatipu COPII Lst1 (Figura S4C). Pirciò, lu raggruppamentu dipinnenti dâ ciramida C26 non richiedi ntirazziuni pruteici cu diversi miccanismi pruteici d'esportazziuni ER, ma supporta nu miccanismu di classificazziuni alternativu guidatu dâ lunghizza dî lipidi. Poi, analizzamu si la lunghizza dâ catina acili di ciramida ntà mimbrana ER è mpurtanti pà classificazziuni efficaci dû Gas1-GFP comu ERES silittivu. Siccomu lu Gas1 ntô ceppu GhLag1 câ ciramida a catina curta lassa l'ER e trasi ntâ mimbrana plasmatica (Figura S5), criemu ca si la scelta è spinti dâ lunghizza dâ catina acili dâ ciramida, lu Gas1 ntô ceppu GhLag1 pò essiri ridiriggiutu e ncruciatu. Beni ERES câ stissa mimbrana.
(A) La mimbrana cellulari di GhLag1 cunteni principalmenti ciramidi C18-C16 cchiù curti, mentri l'ancora GPI di Gas1-GFP avi ancora lu stissu IPC C26 dî celluli di tipu sarvaggiu. Supra: analisi dâ lunghizza dâ catina acilica dâ ciramida ntà mimbrana cillulari di ceppi di tipu sarvaggiu (Wt) e GhLag1p cu spettrumitrìa di massa (MS). Li dati rapprisèntanu la pircintuali di ciramida tutali. A media ri tri spirimenti ‘nnipinnenti. Barra d'erruri = SD. Test t nun accuppiatu a du’ cudi. **** P <0,0001. Panneḍḍu di sutta: analisi MS dâ lunghizza dâ catina acilica di l'IPC prisenti ntà l'ancora GPI Gas1-GFP (GPI-IPC) espressa ntà li ceppi di tipu sarvaggiu e GhLag1p. Li dati riprisèntanu a pircintuali dû signali IPC tutali. Media ri cincu spirimenti ‘nnipinnenti. Barra d'erruri = SD. Test t nun accuppiatu a du’ cudi. ns, nun è mpurtanti. P = 0,9134. (B) Li micrugrafi di fluuriscenza di cèlluli ca esprimunu Gas1-GFP induttu dû galattosiu foru ncubati a 37°C pi micruscopia pi minuti doppu li 24°C. Frèccia janca: gruppu ER Gas1-GFP. Frèccia aperta: lu Gas1-GFP nun raggruppatu è distribbuitu ntà tutta la mimbrana ER, mustrannu la culurazziuni carattirìstica di l'aneḋḋu nucliari ER. Barra di scala, 5μm. (C) Quantificazzioni dû fotumicrugrafu discrittu nnâ (B). La pircintuali media di celluli cu na struttura puntuata Gas1-GFP. Ntâ tri spirimenti nnipinnenti, n≥300 cèlluli. Barra d'erruri = SD. Test t nun accuppiatu a du’ cudi. **** P <0,0001.
Pi arrisòrbiri direttamenti stu prubblema, ficimu la visualizzazziuni SCLIM di Gas1-GFP e Mid2-iRFP ntà GhLag1 cu l'alleli mutanti sinsibbili â timpiratura sec31-1 (Figura 4 e Film S4). Doppu ca l'ER fu tinutu a 37°C e succissivamenti rilasciatu a 24°C, la maggiuranza dû Gas1-GFP sintitizzatu di novu non fu raggruppatu e distribbuitu ntà tutta la mimbrana ER, comu ossirvatu dî micruscopi cumminziunali (Figura 4, A e B). Sparti, na granni pircintuali di ERES (67%) cumprenni dui tipi di carichi co-situati rintra (Figura 4D). Li pannelli 1 e 2 dâ Figura 4C mustranu du' esempi tipici di ERES cu Gas1-GFP e Mid2-GFP suvrapposti. Sparti, ‘ntrammi i bèni foru assunti nnô stissu ERES (Figura 4E, pannellu 3 e film S4). Pirciò, li nostri risultati innicanu câ lunghizza dâ catina acili di ciramida ntà mimbrana ER è nu ditirminanti mpurtanti di l'aggriggazziuni e la classificazziuni dî pruteini ER.
Li cèlluli Sec31-1 GhLag1 ca esprimunu siccirazziuni indutti dû galattosiu, Gas1-GFP (GPI-AP, virdi) e Mid2-iRFP (TMP, blu) e Sec13-mCherry custitutiva marcata cu ERES (ERES, magenta) ncubati a 37°C. Cuntinuari pi 30 minuti, abbassari a 24°C pi rilassari li siccizziuni e l'immaggini cu SCLIM doppu 20 minuti. (A a C) Mmàggini di prujizzioni 2D rapprisintanti (A; barra di scala, 1μm) o mmàggini di l’emisferu di cèlluli 3D (B e C; unità di scala, 0,45μm) dî 10 sizzioni z signati di càrricu e ERES. Lu panneḍḍu cchiù vasciu ‘n (B) e chiḍḍu ‘n (C) mustranu ‘mmaggini prucissati pì mustrari sulu li bèni prisenti ‘n ERES (magenta) [Gas1-GFP (grigiu) e Mid2-iRFP (blu chiaru)]. (C) Frèccia janca china: ERES, li bèni suvrapponnu. Frèccia aperta: ERES cunteni sulu n'uggettu. Pannellu cchiù vasciu: l'ERES scigghiutu havi bèni suvrapposti (1 e 2) signati ‘n (C). Barra di scala, 100 nm. (D) Quantificazzioni dû fotumicrugrafu discrittu nnâ (C). Ntê unità sec31-1 e sec31-1 GhLag1, è nchiusu sulu nu caricu (Gas1-GFP o Mid2-iRFP) e la pircintuali media di ERES pi carichi isulati e carichi suvrapposti. Ntà tri spirimenti nnipinnenti, n = 432 ntà 54 cèlluli (sec31-1) e n = 430 ntà 47 cèlluli (sec31-1 GhLag1). Barra d'erruri = SD. Test t nun accuppiatu a du’ cudi. *** P = 0,0002 (sicunnu 31-1) e ** P = 0,0031 (sicunnu 31-1 GhLag1). (E) Mmàggini 3D di ERES scigghiuti cu càrricu suvrappostu (3) signatu ‘n (C). Gas1-GFP (virdi) e Mid2-iRFP (blu) s'avvicìnanu a l'ERES (magenta) dû stissu latu e ristanu ntà stissa aria ristritta di l'ERES. Barra di scala, 100 nm.
Stu studiu duna provi diretti in vivo ca li carichi pruteici basati nté lipidi sunnu classificati ntà siti d'esportazziuni silittivi ntà via sicritoria e rivela l'impurtanza dâ lunghizza dâ catina acili pà silittività dâ classificazziuni. Usannu na tecnica di micruscopia putenti e avanzata chiamata SCLIM, dimustramu ca lu Gas1-GFP sintitizzatu di novu (na mimbrana plasmatica mpurtanti GPI-AP cu na purziuni lipidica di ciramida a catina acili (C26) assà longa) ntô lievitu) Li riggiuni raggruppati ntà prutiini sicreti distribbuiti attraversu ERER spicìfici, sunnu assuciati cu ERES sigreti. la mimbrana ER (Figura 1). Sparti, chisti dui tipi ri bèni ‘ntrànu selettivamenti nnî ERES addiversi (Figura 2). La lunghizza dâ catina acili dâ ciramida cellulari ntà mimbrana è ridutta di C26 a C18-C16, lu gruppu Gas1-GFP è ruttu ntà riggiuni ER discrita e lu Gas1-GFP è ridiriggiutu pi lassari l'ER câ pruteina transmimbrana attraversu lu stissu ERES (Figura 3 e Figura 3). 4).
Puru si lu GPI-AP usa nu miccanismu pruteicu spicializzatu pi nesciri di l'ER, attruvaumu câ siparazziuni dipinnenti dâ ciramida C26 non si basa su li ntirazziuni pruteici diffirinziali ca ponnu purtari â spicializzazziuni ERES (Figuri S4 e S5). Mmeci, li nostri risultati supportunu nu miccanismu di classificazziuni alternativu guidatu dû raggruppamentu dî proteini basati nté lipidi e la succissiva esclusiuni di autri carichi. Li nostri osservazziuni innicanu câ riggiuni o gruppu Gas1-GFP assuciatu a nu spicìficu ERES nun àvi la prutiina secreta dâ transmimbrana Mid2-iRFP, ca innica ca lu gruppu GPI-AP dipinnenti dâ ciramida C26 facilitarà l'ingressu ntà l'ERES rilivanti, e ntò stissu tempu, escludi stu sicretariu particulari dâ trasmimbrana ( 2). Ô cuntrariu, la prisenza dî ciramidi C18-C16 ntà mimbrana ER non fa furmari riggiuni o gruppi dû GPI-AP, quinni non escludunu o sostituisciunu li pruteini secreti transmimbrani ntà stissa ERES (Figuri 3 e 4). . Pirciò, prupunimu ca la ciramida C26 spinci la siparazziuni e la classificazziuni facilitannu lu raggruppamentu di pruteini ligati a spicìfici ERES.
Comu ottèniri chistu raggruppamentu dipinnenti dâ ciramida C26 nna na spicìfica ària ER? La tinnenza dâ ciramida dâ mimbrana mi si sipara latiralmenti pò fari ca la ciramida GPI-AP e C26 formunu lipidi picciriḋḋi e ordinati istantaneamenti ntà l'ambienti lipidicu cchiù irregulari dâ mimbrana ER ca cunteni glicirolipidi cchiù curti e insaturati. Gruppi ri qualitàti (17, 18). Sti gruppi timpurani nichi ponnu essiri ultiriurmenti fusi ntà gruppi cchiù granni e stàbbili doppu ca si liganu ô cumplessu p24 (34). Coerenti cu chistu, mustramu ca C26 Gas1-GFP avi bisognu di ntiraggiri cû cumplessu p24 pi furmari gruppi visibbili cchiù granni (Figura 3). Lu cumplessu p24 è n'oligumeri eterozzigoti cumpostu di quattru pruteini transmimbrani p24 diversi ntà lu lievitu (35), ca duna nu ligami multivalenti, ca pò purtari ô culligamentu ncruciatu di gruppi GPI-AP picciriḋḋi, ginirannu accussì nu gruppu stàbbili cchiù granni (34). La ntirazziuni tra l'ectudumini pruteici dî GPI-AP pò cuntribbuiri puru â sò aggriggazziuni, comu mustratu duranti lu sò trasportu di Golgi nté celluli epiteliali pularizzati dî mammìfiri (36). Com'è gghiè, quannu la ciramida C18-C16 è prisenti ntà mimbrana ER, quannu lu cumplessu p24 si liga ô Gas1-GFP, non si furmunu gruppi siparati granni. Lu miccanismu suttustanti pò dipenniri dî prupità fisichi e chimichi spicifici dâ ciramida a catina acilica longa. Li studi biufìsici dî mimbrani artificiali mustranu ca puru si li ciramidi a catina acilica longa (C24) e curta (C18-C16) ponnu causari la siparazziuni di fasi, sulu li ciramidi a catina acilica longa (C24) ponnu prumòviri n'auta curvatura e na curvatura dû film pi rimudellari la pillìcula. Attraversu lu rifirimentu ricìprocu (17, 37, 38). Vinni dimustratu ca l'elica transmimbrana di TMED2, l'omòlugu umanu di Emp24, intiraggisci silittivamenti câ sfingumielina basata ntà ciramida C18 ntà li lobuli cituplasmatici (39). Usannu li simulazziuni dâ dinàmica muliculari (MD), attruvamu ca sia li ciramidi C18 ca chiḋḋi C26 s'accumulunu ntunnu ê lòbbuli cituplasmatici di l'elica transmimbrana Emp24 e hannu prifirenze simili (Figura S6). Si noti ca chistu innica ca l'elica transmimbrana di Emp24 pò purtari a na distribbuzziuni asimetrica dî lipidi ntà mimbrana. Chistu è nu risultatu ricenti basatu ncapu li cèlluli dî mammìfiri. Simulazziuna di MD sìmili mustranu macari la prisenza di lipidi ètirici (40). Pirciò, pinzamu ca la ciramida C26 ntà li du lobuli di ER26 è arricchita lucalimenti. Quannu lu GPI-AP nté lòbbuli luminal si liga direttamenti ô p24 multivalenti e l'accumulu di ciramida C26 ntunnu ô p24 nté lòbbuli cituplasmatici, pò prumòviri l'aggriggazziuni pruteica accumpagnanti e la curvatura dâ mimbrana sunnu ginirati attraversu li jìdita (41), facennu sì ca lu GPI-AP si sipara puru ntà riggiuni adcentja auta, ca favurisci puru l'es discri. riggiuni dâ mimbrana ER (42). Li rapporti pricidenti sustinìanu u meccanìsimu prupostu (43, 44). Lu ligami multivalenti di l'oligulèttini, li patuggini o l'anticorpi ê glicosfingulipidi basati ntà ciramida (GSL) ntà mimbrana plasmatica attiva n'aggriggazziuni GSL ranni, migliora la siparazziuni dî fasi e causa la difurmazziuni e l'internalizzazziuni dâ mimbrana (44). Iwabuchi ecc. (43) Si scoprìu ca ntà prisenza di catini acili longhi (C24) ma non curti (C16), lu lianti multivalenti ligatu â lattusilciramida GSL induciu la furmazziuni di gruppi ranni e l'invaginazziuni dâ mimbrana, e la trasduzziuni dû signali mediata dô cituplasma di Lyn ntà li fogghi di l'accitrupili è l'interru.
Ntà li celluli epiteliali pularizzati dî mammìfiri, la cuncintrazziuni dâ riti anti-Golgi (TGN) ntò livellu dâ mimbrana plasmatica apicali cuntrolla la siparazziuni e l'urdinamentu dû GPI-AP (10, 45). Chista aggriggazziuni è spinti di l'oligumirizzazziuni GPI-AP (36), ma pò dipenniri puru dâ lunghizza dâ catina dâ ciramida ca attruvamu ntà lu lievitu. Puru si lu GPI-AP dî mammìfiri avi n'ancora a basi di lipidi di l'eteri e la sò struttura chimica è assà diversa dâ ciramida a catina acili assà longa, nu studiu ricenti attruvau ca sia li lipidi hannu prupità e funziuni fisichi e chimichi evuluzziunarmenti simili (40). Pirciò, la parti lipidica di l'eteri ntà li celluli dî mammìfiri pò essiri simili â ciramida C26 ntà lu lievitu e lu sò rolu è d'associarisi câ ciramida a catina longa ntà mimbrana pi prumoviri l'aggriggazziuni e l'urdinamentu GPI-AP. Puru si sta pussibbilità havi ancora a essiri tistata direttamenti, li risultati pricidenti supportunu ca lu trasportu dâ ciramida a catina acilica longa ntò corpu di Golgi non è fattu di proteini di trasfirimentu cituplasmaticu, ma dipenni dâ sintisi di l'ancori GPI comu lu lievitu. Pirciò, lu miccanismu cunservaturi evulutivu pari essiri capaci di co-traspurtari silittivamenti la ciramida a catina acili assà longa e lu GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) ntà stissa vescicula di trasportu.
Ntà li sistemi cellulari epiteliali pularizzati dû lievitu e dî mammìfiri, l'aggriggazziuni GPI-AP e la siparazziuni di l'autri pruteini dâ mimbrana plasmatica si virifica tutti prima d'agghicari â supirfici dâ cellula. Paladinu e àutri. (48) attruvaru ca ntà lu TGN dî celluli epiteliali pularizzati dî mammìfiri, lu raggruppamentu GPI-AP non è sulu nicissariu pà classificazziuni silittiva dî GPI-AP ntà mimbrana plasmatica apicali, ma regula puru l'organizzazziuni di raggruppamentu dî GPI-AP e la sò attività biuloggica. Supirfici dâ cèllula. Ntô lievitu, stu studiu mustrò ca lu gruppu GPI-AP dipinnenti dâ ciramida C26 ntà l'ER pò rigulari l'organizzazziuni dû gruppu e l'attività funziunali dû GPI-AP ntà mimbrana plasmatica (24, 49). Coerenti cu stu mudellu, li celluli GhLag1 sunnu allèrgici a l'inibbituri GPI o li medicini ca nfruenzunu l'intigrità dî pariti cellulari (28), e la necessità di gruppi funziunali Gas1-GFP (49) dâ ciramida di punta prujittata ntà l'accuppiamentu dî celluli dû lievitu innica G Pussibbili cunsiquenzi fisiuloggici di hLag1. Erruri GPI-AP. Com'è gghiè, ultiriuri provi si l'organizzazziuni funziunali dâ supirfici cellulari fu prugrammata di l'ER cu nu mètudu di scelta basatu ntà lunghizza dî lipidi sarà l'uggettu dâ nostra ricerca futura.
Li ceppi di Saccharomyces cerevisiae usati nna stu travagghiu su' ripurtati nnâ Tabbula S1. Li ceppi MMY1583 e MMY1635 di SCLIM pi l’immaggini di cèlluli viventi foru custrujuti ncapu lu sfunnu di W303. Sti ceppi ca esprimunu Sec13-mCherry cu nu tag di prutiini fluoriscenti foru custrujuti usannu nu mètudu basatu ncapu la riazziuni a catina dâ polimirasi (PCR) cû plàsmidi pFA6a comu mudellu (23). Lu ceppu ca esprimi Mid2-iRFP marcatu cu na proteina fluoriscenti sutta lu cuntrollu dû promoturi GAL1 fu custruiutu comu si vidi appressu. L'amplificazzioni PCR dâ siquenza iRFP-KanMx dû vitturi pKTiRFP-KAN (rigalu di E. O'Shea, plàsmidi Addgene nùmmaru 64687; identificaturi di risursi di ricerca (RRID): Addgene_server-mintatu ntô C2dgen Doppu ca la siquenza dû ginoma Mid2-iRFP fu amplificata e clunata nnô prumuturi GAL1, fu ntigrata nnô situ Not I-Sac I dû plàsmidi di ntigrazzioni pRS306. Lu plàsmidi ca risurtau pRGS7 fu liniarizzatu cu Pst I pi ntigrari ntô locus URA3.
Lu geni di fusiuni Gas1-GFP è espressu sutta lu cuntrollu dû promoturi GAL1 ntô plàsmidi centrumeri (CEN), ca è custruiutu comu si vidi appressu. La siquenza Gas1-GFP fu amplificata cu PCR dû plàsmidi pRS416-GAS1-GFP (24) (rigalu di L. Popolo) e clunata nnô situ Xma I-Xho I dû plàsmidi CEN pBEVY-GL LEU2 (rigalu di C). mulinu; Lu plàsmidi adginènicu nùmmaru 51225; 51225; RRID: Agghiuncitina_51225). Lu plàsmidi ca risurtau fu chiamatu pRGS6. Lu geni di fusiuni Axl2-GFP è puru espressu sutta lu cuntrollu dû promoturi GAL1 dû vitturi pBEVY-GL LEU2 e la sò custruzziuni è la siguenti. La siquenza Axl2-GFP fu amplificata dû plàsmidi pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) cu PCR, e clunata nnô situ Bam HI-Pst I dû vitturi LEU2 pBEVY-GL. Lu plàsmidi ca risurtau fu chiamatu pRGS12. La siquenza di l'oligunucliotidi usati ntà stu studiu è ripurtata ntà tabbella S2.
Lu ceppu fu ntigratu cu 0,2% di adinina e 2% di glucosiu [YP-distrosi (YPD)], 2% di raffinosa [YP-raffinosa] estrattu di lievitu riccu di prutiina p (YP) (1% estrattu di lievitu e 2% prutiina ept). (YPR)] o 2% galattosiu [YP-galattosiu (YPG)] comu funti di carboniu, o nta nu menzu minimu sintèticu (0,15% basi di azzotu di lievitu e 0,5% surfatu d'ammuniu) pi ntigrari l'amminuacidi e basi apprupriati nicissari pâ nutrizziuni, e cuntinenti lu 2% di glucosiu sinteticu2) (mediu mìnimu di galattosiu sintèticu) comu funti di carboniu.
Pi fari l’immagginazziuni ‘n tempu riali, li cèlluli mutanti sec31-1 sinsìbbili â timpiratura ca esprimunu lu custruttu sutta lu prumuturi GAL1 foru crisciuti ntô menzu YPR a 24°C duranti la notti nzinu â fasi mità dû log. Doppu l'induzziuni ntà YPG a 24°C pi 1 ura, li celluli furu ncubati ntà SG a 37°C pi 30 minuti e poi trasferiti a 24°C pi libbirarisi dû bloccu di siccizziuni. La cuncanavalina A fu usata pi fissari li cèlluli nna na vetrina e mmàgginata di SCLIM. SCLIM è na cumminazzioni di micruscopiu a fluuriscenza nvirtita Olympus IX-71 e lenti a ogghiu cu apirtura numèrica UPlanSApo 100×1,4 (Olympus), scanner cunfucali a discu rutanti a granni vilucità e rapportu signali-rumoru àutu (Yokogawa Electric e su misura), spettrumètru di mmàggini su misura (Futònica Hamamatsu) po furniri un sistema di lenti di ngrannimentu cu n’ingrannimentu finali di ×266,7 e na càmira di dispusitivi accuppiati a càrrica ca murtiplica l’elittruna (Futònica Hamamatsu) (21). L'acquisizzioni di l'immaggini veni fatta cu nu prugramma su misura (Yokogawa Electric). Pi mmàggini 3D, usamu n’attuaturi piezuelèttricu fattu su misura pi vibbrari la lenti uggittiva ‘n virticali, e arricuogghiemu li parti uttichi a 100 nm di distanza nna na pila. L’immaggini dû munzeḍḍu Z veni cummirtuta ‘n dati vuxelli 3D, e la funzioni tiòrica di diffusioni dû puntu usata pû micruscopiu cunfucali a discu rutanti veni usata pû prucessu di dicunvuluzzioni dû prugramma Volocity (PerkinElmer). Usannu lu prugramma Volocity pi limitari autumàticamenti l'anàlisi di co-lucalità, fu misuratu l'ERES cumprisu lu càrricu. L'anàlisi dâ scanziuni a linia fu fatta usannu lu prugramma MetaMorph (Dispusitivi muliculari).
Usa lu prugramma GraphPad Prism pi ditirminari lu significatu statìsticu. Pî test t ri Student a dui cudi e u test urdinariu ri analisi unidirezzionali dâ varianza (ANOVA), li differenze ntra li gruppi sunnu cunzidiràti aviri n’impattu significativu supra P <0,05 (*).
Pi la micruscopia a fluuriscenza di Gas1-GFP, li cèlluli di fasi log foru crisciuti duranti la notti nna YPD e arricugghiuti pi centrifugazzioni, lavati du' voti cu salina tampunizzata cu fusfatu e ncubati ncapu lu ghiacciu pi armenu 15 minuti, e poi pruciduti sutta lu micruscopiu comu discrittu prima (Check24). Pi l’acquisizzioni fu usatu lu micruscopiu Leica DMi8 (ogghiu HCX PL APO 1003/1,40 PH3 CS) dutatu di na lenti uggittiva, nu filtru L5 (GFP), na càmira Hamamatsu e nu prugramma Application Suite X (LAS X). .
Li campioni foru dinaturati cû tampuni dû campioni SDS a 65°C pì 10 minuti e quinni siparati cû elettroforesi ‘n gel ri poliacrilamida SDS (PAGE). Pî l’analisi ‘mmunublotting, foru caricati 10 μl ri campioni pì corsia. Anticorpu primariu: usari l'anti-Gas1 policlunali dû cunigghiu a na diluizziuni di 1:3000, l'anti-Emp24 policlunali dû cunigghiu a na diluizziuni di 1:500 e l'anti-GFP policlunali dû cunigghiu (nu rigalu di H. Riezman) a na diluizziuni di 1:3000. L’anticorpu monuclunali anti-Pgk1 dû surci fu usatu a na diluizziuni di 1:5000 (nu rigalu di J. de la Cruz). Anticorpu sicunnariu: l'immunuglubbulina G (IgG) di crapa coniugata dâ perossidasi dû ravanu (HRP) usata a na diluizziuni di 1:3000 (Pierce). L'IgG anti-surci di crapa coniugata cu HRP fu usata a na diluizzioni di 1:3000 (Pierce). La zona di risposta immunitaria fu ossirvata cû mètudu di chimiluminiscenza dû riaggenti SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific).
Comu discrittu ntà (31), fu fattu nu spirimentu di immunupricipitazziuni naturali ntà frazziuni ER arricchita. ‘N brevi, lavari li cèlluli dû lievitu cu nu tampuni TNE [50 mM tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM flùoru di finilmitilsulfunili e misculanza di inibbituri di prutiasi) a 600 nm (OD600 disinsìticu) a 100 voti. Fu ruttu cu pirlini di vitru e poi li detriti dî cèlluli e li pirlini di vitru foru livati ​​câ centrifugazzioni. Lu supranatanti fu poi centrifugatu a 17.000 g pi 15 minuti a 4°C. Lu pellet fu risuspinnutu nta TNE e la sapunina diggitali fu agghiunciuta a na cuncintrazzioni finali di l'1%. La suspinsioni fu ncubata pi 1 ura cu rutazzioni a 4°C e poi li cumpunenti nun sulubbili foru livati ​​cu centrifugazzioni a 13.000 g a 4°C pi 60 minuti. Pî ‘mmunupricipitazzioni Gas1-GFP, prima pri-ncubari u campioni cu perli ri agarosi vacanti (ChromoTek) a 4°C pì 1 ura, e poi ‘ncubari cû GFP-Trap_A (ChromoTek) a 4°C pì 3 uri. Li pirlini immunupricipitati foru lavati cincu voti cu TNE ca cuntinìa lu 0,2% di digossigginina, eluiti cû tampuni dû campioni SDS, siparati ncapu SDS-PAGE e analizzati cu l'immunutrasferimentu.
Comu discrittu ntà (31), la ditirminazziuni dû culligamentu ncruciatu fu fatta ntà frazziuni ER arricchita. Pi brevi, la frazziuni ER arricchita fu ncubata cu 0,5 mM di ditiobbi (prupiunatu di succinimidili) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, 20 min). La riazzioni di culligamentu fu stizzata agghiuncennu glicina (cuncintrazziuni finali di 50 mM, 5 minuti, 20°C).
Comu discrittu prima (50), fu fatta l'analisi MS dâ ciramida nne ceppi di tipu sarvaggiu e GhLag1. ‘N brevi, li cèlluli foru crisciuti â fasi espuninziali (3-4 unità OD600/ml) nnâ YPD a 30°C e foru arricugghiuti 25x107 cèlluli. Lu sò metabbulismu è stimatu cu l'acidu tricloruacèticu. Usa sulventi d'estrazzioni [etanolu, acqua, ètiri, piridina e idròssidu d'ammuniu 4,2 N (15:15:5:1:0,018 v/v)] e 1,2 nmol di ciramida C17 standard nterna (860517, lipidi pulari Avanti) di qualità). Usa lu riaggenti munumitilamina [mitanolu, acqua, n-butanolu e suluzzioni di mitilamina (4:3:1:5 v/v)] pi fari n'idròlisi alcalina liggiera di l'estrattu, e poi usa lu n-butanolu saturatu d'acqua pi disalari. Â fini, l'estrattu fu risuspinnutu nna un sulventi ‘n modalità pusitiva [clorufurmu/mitanolu/acqua (2:7:1) + 5 mM acitatu d'ammuniu] e iniettatu nnô spettròmitru di massa. Lu monitoraggiu multi-riazzioni (MRM) fu fattu pi l'identificazziuni e la quantificazziuni dî muleculi di sfingulipidi. Lu spettrumètru di massa quadrupuli tirziariu TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) è dutatu di na funti di joni a nanuflussu rubbòticu Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) pi l'anàlisi dî lipidi. L’enirgìa di cullisiuni è uttimizzata pi ogni catigurìa di ciramida. Li dati MS foru uttinuti ‘n modalità positiva. Pi ogni rèplica biuloggica, lu signali lipidicu è la mediana di tri misurazziuni innipinnenti.
Comu discrivutu ntà (31), li cèlluli (800x107) ca esprimunu Gas1-GFP furu suggetti a n'immunupricipitazziuni naturali. Lu Gas1-GFP purificatu fu siparatu di SDS-PAGE e trasfirutu a na mimbrana di fluoru di polivinilidenu (PVDF). La prutiina fu visualizzata culurannu lu PVDF cu l'amidu niuru. La banna Gas1-GFP fu tagghiata dû PVDF e lavata 5 voti cû mitanolu e na vota cu acqua di qualità cromatografìa liquida-MS (LC-MS). Ncubannu la striscia di mimbrana cu 500 μl di NaOAc 0,3 M (pH 4,0), tampuni e 500 μl di na miscela di nitritu di sodiu 1 M appena dissolta a 37°C pi 3 uri, la frazziuni lipidica è rilassata di Gas1-GFP e lissiatu di glucosaminolu (51). Doppu, la striscia di mimbrana fu lavata quattru voti cu acqua di qualità LC-MS, asciugata a timpiratura ambienti e sarbata nna n'atmusfera di azzotu a -80°C nzinu a l'analisi. Comu cuntrollu, fu usatu 'n campioni ‘n biancu ri mimbrana ri PVDF pì ogni spirimentu. Lu lipidi estrattu di Gas1-GFP fu poi analizzatu di MS comu discrittu (50). ‘N brevi, li strisci di PVDF ca cuntinìanu lipidi GPI foru risuspinnuti ‘n 75 μl di sulventi di muffa nigatìvu [clorufurmu/mitanolu (1:2) + 5 mM acitatu d’ammuniu] e passati l’analisi MRM/MS di speci di sfingulipidi (TSQ Vantage). Nna stu casu, li dati MS foru uttinuti ‘n modalità joni nigativi.
Comu dittu prima, la purziuni lipidica di l'ancora GPI fu siparata dû GPI-AP marcatu cu [3H]-inositolu (16). Li lipidi foru siparati cu na cromatugrafia a stratu suttili usannu nu sistema sulventi (55:45:10 clorufurmu-mitanolu-0,25% KCl) e visualizzati usannu FLA-7000 (Fujifilm).
Li cèlluli ca esprimunu Gas1-GFP (600x107) foru lavati du' voti cu nu tampuni TNE cu nu tampuni TNE, e rutti cu pirlini di vitru, e poi centrifugati pi livari li detriti di cèlluli e li pirlini di vitru. Lu supranatanti fu poi centrifugatu a 17.000 g pi 1 ura a 4°C. Lu pellet fu lavatu 'n TNE e ncubatu cu 1 U PI-PLC (Invitrogen) 'n TNE ca cuntinìa lu 0,2% di sapunina diggitali pi 1 ura a 37°C. Doppu lu trattamentu cu l'enzimi, la mimbrana fu livata cu centrifugazziuni a 17.000 g a 4°C pi 1 ura. Pi mmunupricipitari Gas1-GFP, lu supranatanti fu ncubatu cu GFP-Trap_A (ChromoTek) a 4°C duranti la notti. Lu Gas1-GFP purificatu siparatu di SDS-PAGE fu culuratu cu blu brillanti di Coomassie. La fascia di culurazzioni Gas1-GFP fu tagghiata dû grigiu ca circonna l'acquedottu e poi doppu l'alchilazzioni cu joduacitamida e la riduzzioni cu ditiotreitolu, fu fatta la diggistiuni 'n gel câ tripsina. Estrari e asciugari li peptidi triptici e li peptidi cu GPI-glicani. Lu peptidi siccu fu dissoltu nta 20 μl d'acqua. Iniettari na parti (8μl) ntô LC. Na culonna di ottadicilsilanu (ODS) (Divelosil 300ODS-HG-5; diàmitru nternu 150 mm x 1,0 mm; Chimica Nomura, Prifittura di Aichi, Giappuni) fu usata pi siparari li peptidi 'n cunnizzioni di gradienti spicìfici. La fasi mubbili è lu sulventi A (0,08% àcitu furmicu) e lu sulventi B (0,15% àcitu furmicu ntà l'80% di acitunitrili). Nu sistema HPLC Accela (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) fu usatu pi eluiri la culonna cû sulventi A nta 55 minuti a nu tassu di purtata di 50 μl min-1 pi 5 minuti, e poi la cuncintrazzioni dû sulventi B fu aumintata ô 40%. , Stati Uniti). L'eluatu fu ntruduttu cuntinuamenti nnâ funti di joni ESI, e li pèptidi triptici e li pèptidi cu GPI-glicani foru analizzati di LTQ Orbitrap XL (spettrumètru di massa liniari ibbridi di trappu di joni-orbitrap; Thermo Fisher Scientific). Ntâ cunfigurazzioni MS, lu vurtaggiu dâ funti capillari fu misa a 4,5 kV e la timpiratura dû capillari di trasfirimentu fu mantinuta a 300°C. Lu vurtaggiu capillari e lu vurtaggiu dâ lenti dû tubbu foru misa rispittivamenti a 15 V e 50 V. Li dati MS foru uttinuti ‘n modalità iònica pusitiva (risuluzzioni di 60.000; accuratizza di massa di 10 parti ô miliuni) nna n’intervallu di massa di 300/m/z rapportu massa/carica (m/z) 3000. Li dati MS/MS s’uttèninu ‘ntraversu la trappula iònica nnô XLsbit prima lu [Ors3 dissociazzioni ‘ndutta dâ cullisiuni (CID)].
Li simulazziuna di MD foru fatti usannu lu prugramma GROMACS (52) e lu campu di forza MARTINI 2 (53-55). Lu custrutturi di mimbrani GUI CHARMM (56, 57) fu poi usatu pi custrujiri un stratu doppiu ca cunteni diuliuilfusfatidilcolina (DOPC) e Cer C18 o DOPC e Cer C26. La topuluggìa e li cuurdinati di Cer C26 vennu di DXCE livannu li pirlini suverchi dâ cuda di sfingusina. Usa lu prucessu discrittu sutta pi bilanciari lu liveḍḍu duppiu e farilu girari, poi usa l'ùrtimi cuurdinati dû sistema pi custrujiri un sistema ca cunteni Emp24. Lu duminiu transmimbranu dû lievitu Emp24 (risidui 173 nzinu a 193) fu custrujutu comu n'elica α usannu la struttura muliculari dû strumentu visivu MD (VMD) (58). Poi, doppu ca li lipidi suvrapposti livaru, la prutiina fu granulata grossamenti e misi ntô stratu doppiu usannu la GUI CHARMM. Lu sistema finali cunteni 1202 DOPC e 302 C26 o 1197 DOPC e 295 C18 e Emp24. Junizzari lu sistema a na cuncintrazzioni di 0,150 M. Furu fatti quattru rèplichi nnipinnenti pi du' cumpusizzioni a strati doppi.
Lu stratu doppiu lipidicu è bilanciatu usannu lu prucessu GUI CHARMM, ca cumporta la minimizzazziuni e poi l'equilibbriu di 405.000 passaggi, aunni li vinculi di pusizziuni sunnu a picca a picca riduciuti e eliminati, e lu passaggiu di tempu aumenta di 0,005 ps a 0,02 ps. Doppu l’equilìbbriu, pruduci 6 μs cu nu passaggiu di tempu di 0,02 ps. Doppu ca misi Emp24, usa lu stissu prucessu GUI CHARMM pi ridduciri ô minimu e bilanciari lu sistema, e poi fari girari pi 8 s di pruduzzioni.
Pi tutti li sistemi, duranti lu prucessu di bilanciamentu, la prissioni è cuntrullata dû barustatu di Berendsen (59), e duranti lu prucessu di pruduzzioni, la prissioni è cuntrullata dû barustatu di Parrinello-Rahman (60). Nta tutti li casi, la prissioni media è di 1 bar e si usa nu schema d’accuppiamentu di prissioni semi-isòtropi. Ntô prucessu di bilanciu e pruduzzioni, nu tirmòstatu (61) câ ricalibrazzioni di vilucità veni usatu pi accuppiari la timpiratura rispittivamenti dî particeḍḍi prutìichi, lipidichi e sulventi. Duranti tuttu l'upirazzioni, la timpiratura di mira è di 310K. La ntirazziuni non ligami è calculata ginirannu na lista d'accoppiamentu usannu lu schema di Verlet cu na tulliranza dû buffer di 0,005. Lu tèrmini di Coulomb è carculatu usannu lu campu di riazzioni e na distanza di tagghiu di 1,1 nm. Lu tèrmini di Vander Waals usa un schema di tagghiu cu na distanza di tagghiu di 1,1 nm, e lu schema di tagghiu di Verlet veni usatu pâ diviazzioni putinziali (62).
Usannu lu VMD, la lunghizza d'unna di tagghiu ntra li perli di fusfatu DOPC o li perli di ciramida AM1 e la prutiina è di 0,7 nm e si calcula lu nùmmaru di lipidi ca ntiraggìscinu câ prutiina. Secunnu la furmula siquenti, carcula lu fatturi di dipluzzioni-arricchimentu (DE) comu ntà (63): fatturi DE = (la quantità di lipidi totali ntà prutiina 0,7) ntà prutiina 0,7 (la quantità di Cer ntà lipidi totali)
Lu valuri ripurtatu veni uttinutu comu media, e li barri d'erruri su' quattru copi nnipinnenti di SE. Lu significatu statìsticu dû fatturi DE è calculatu cû test t [(fatturi-DE-mediu-1)/SE]. Carcula u valuri P dâ distribbuzzioni a na cuda.
Lu strumentu GROMACS fu usatu pi carculari la mappa di dinsità latirali 2D dû sistema ca cunteni Emp24 nnî ùrtimi 250 ns dû tracciu. Pî uttèniri la mappa di l'arricchimentu/impoverimentu dâ ciramida, la mappa dâ dinsità di Cer è divisa pâ summa dâ mappa di Cer e DOPC, e poi divisa pâ cuncintrazzioni di Cer ntô corpu. Si usa la stissa scala dâ mappa di culura.
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Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez Lorgihope -Linero), Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
L’immaggini 3D a àuta risuluzzioni ‘n tempu riali mustranu l’impurtanza dâ lunghizza dâ catina dâ ciramida pâ scelta dî prutiini nnî siti di output silittivi.
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©2020 Associazzioni ‘miricana pû prugressu dâ scienza. tutti li diritti riservati. AAAS è nu cumpagnu di HINARI, AGORA, OARE, CORO, CLOCKSS, CrossRef e CONTATOR. Avanzamenti dâ Scienza ISSN 2375-2548.