Li metabboliti immunumodulaturi sunnu na carattirìstica chiavi dû micruambienti dû tumuri (TME), ma cu quarchi eccizziuni, li sò identità restu assà scanusciuti. Ccà, analizzamu li tumuri e li cèlluli T dî tumuri e di l'asciti dî pazzienti cu carcinoma sirusu di gradu àutu (HGSC) pi rivilari lu metabbulumu di sti diversi cumpartimenti TME. L'asciti e li celluli tumuriali hannu diffirenzi metabbolitichi ampi. Ô cunfrontu di l'asciti, li celluli T ca nfiltrunu lu tumuri sunnu assà arricchiuti cu 1-metilnicutinamida (MNA). Puru si lu livellu di MNA ntà li celluli T è jautu, l'esprissiuni dâ nicotinamida N-metiltransfirasi (n'enzima ca catalizza lu trasfirimentu dî gruppi di mitilu dâ S-adenosilmetionina â nicotinamida) è limitata ê fibbroblasti e ê celluli tumorali. Funziunalmenti, lu MNA innica li celluli T pi ammucciari la citucina ca prumovi lu tumuri lu fatturi alfa di nicrusi dû tumuri. Pi chissu, lu MNA ca veni dû TME cuntribbuisci â regolazziuni immunitaria dî cèlluli T e è n’obbiettivu di immunuterapia putinziali pû trattamentu dû càncaru umanu.
Li metabboliti dirivati ​​dî tumuri ponnu aviri n'effettu inibbituri prufunnu ntà l'immunità antitumorali e sempri cchiù provi mustranu ca ponnu puru èssiri na forza mottrici chiavi pà prugrissiuni dâ malatia (1). Sparti di l'effettu Warburg, nu travagghiu ricenti accuminciau a carattirizzari lu statu metabolicu dî celluli tumorali e la sò rilazziuni cû statu immunitariu dû micruambienti tumorali (TME). Li studi nté mudelli di surci e li celluli T umani mustraru ca lu metabbulismu dâ glutamina (2), lu metabbulismu ossidativu (3) e lu metabbulismu dû glucosiu (4) ponnu aggiri innipinnentimenti ntà vari suttagruppi di celluli immunitari. Diversi metabboliti ntà sti vie inibbisciunu la funziuni antitumorali dî celluli T. Si dimustrò ca lu bloccu dû coenzima tetraidrobiopterina (BH4) pò danniari la prolifirazziuni dî celluli T e l'aumentu di BH4 ntò corpu pò migghiurari la risposta immunitaria antitumorali mediata di CD4 e CD8. Sparti, l'effettu immunusuppressivu dâ chinurenina pò essiri salvatu câ somministrazziuni di BH4 (5). Ntà lu glioblastoma mutanti di l'isocitratu diidroginasi (IDH), la siccirazziuni di l'enantiumitabbòlicu (R)-2-idrossiglutaratu (R-2-HG) inibbisci l'attivazziuni dî celluli T, la prulifirazziuni e l'attività di citulisi (6). Urtimamenti, fu dimustratu ca lu metilgliossali, nu suttapruduttu dâ glicolisi, è pruduttu di celluli suppressuri d'uriggini mieloidi e lu trasfirimentu dî celluli T dû metilgliossali pò inibiri la funziuni dî celluli T effetturi. Ntô trattamentu, la niutralizzazziuni dû metilgliossali pò supirari l'attività dî celluli suppressuri dirivati ​​dî mieloidi (MDSC) e migghiurari sinergisticamenti la terapia dû bloccu dû checkpoint nté mudelli di surci (7). Sti studi cullittivamenti enfatizzunu lu rolu chiavi dî metabboliti dirivati ​​dâ TME ntà rigulazziuni dâ funziuni e l'attività dî celluli T.
La disfunziuni dî celluli T fu ampiamenti ripurtata ntô cancru a l'ovari (8). Chistu è in parti duvutu ê caratteristichi metabolichi inerenti all'ipossia e â vasculatura tumorali anormali (9), ca porta â cunvirsiuni dû glucosiu e dû triptòfanu ntà suttaprudutti comu l'acidu latticu e la chinurenina. Lu lattatu extracellulari eccessivu arridduci la produzziuni di l'interfiruni-γ (IFN-γ) e spinci la diffirenziazziuni dî suttagruppi mielosuppressivi (10, 11). Lu cunsumu di triptòfanu inibbisci direttamenti la prulifirazziuni dî celluli T e inibbisci la signalazziuni dû ricipituri dî celluli T (12-14). Nustanti chisti osservazziuni, fu fattu assài travagghi ncapu lu metabbulismu immunitariu ntâ cultura di cèlluli T in vitro usannu media ottimizzati o limitati a modelli di surci omolughi in vivo, ca nuḍḍu rifletti completamenti l'eterogginità dî càncaru umani e l'ambienti macro e micro fisiuloggicu.
Na carattirìstica cumuni dû cancru a l'ovari è la diffusioni pirituniali e la cumparsa di l'asciti. L'accumulu di fluidi cellulari ntà l'asciti è assuciatu a na malatia avanzata e na prugnosticu scarsa (15). Secunnu li rilazziuni, stu cumpartimentu unicu è ipossicu, avi livelli auti di fatturi di criscita endoteliali vasculari (VEGF) e indoliamina 2,3-diossigginasi (IDO), e è infiltratu di celluli rigulaturi T e celluli inibbituri mieloidi (15-18). L'ambienti metabbolicu di l'asciti pò essiri diversu di chiḋḋu dû tumuri stissu, quinni la riprogrammazziuni dî celluli T ntò spazziu pirituniali non è chiara. Sparti, li diffirenzi chiavi e l'eterogginità tra l'asciti e li metabboliti prisenti ntà l'ambienti dû tumuri ponnu ostaculari l'infiltrazziuni dî celluli immunitari e la sò funziuni nté tumuri, e sunnu nicissari ulteriuri ricerchi.
Pî arrisòrbiri sti prubblemi, pruggittamu nu mètudu di siparazziuni cellulari sinsibbili e spettrumetria di massa tandem di cromatografìa liquida (LC-MS/MS) pi studiari diversi tipi di celluli (inclusi li celluli T CD4 + e CD8 +) ortri ca dintra e ntra li tumuri. Li sò metabboliti spannunu li celluli ntà stissa ascita e l'ambienti dû pazzienti dû pazzienti. Usamu stu mètudu nzemmula â citumetria a flussu a granni diminsiuni e lu siquenziamentu di l'RNA a cellula singula (scRNA-seq) pi dari nu ritrattu assà risoltu dû statu metabbolicu di sti populazziuni chiavi. Chistu mètudu mustrau n’aumentu significativu dû livellu di 1-metilnicotinamida (MNA) ntê cèlluli T dû tumuri e li spirimenti in vitro mustraru ca l’effettu immunumodulaturi dû MNA ntâ funziuni dî cèlluli T prima era scanusciutu. In ginirali, stu mètudu rivela li ntirazziuni metabolichi ricìprochi tra tumuri e celluli immunitari e duna ntuizziuni unichi ntà li metabboliti dâ regolazziuni immunitaria, ca ponnu essiri utili pò trattamentu di l'opportunità di trattamentu di l'immunuterapia basata ncapu li celluli T dû cancru a l'ovari.
Usamu la citumetria a flussu a granni diminziuni pi quantificari simultaniamenti l'assorbimentu di glucosiu [2-(N-(7-nitrufinili-2-ossa-1,3-diaza-4-il)amminu)-2-disussiglucosiu (2-NBDG) e l'attività mitucondriali [MitoTracker Deep Red, DR01) marcaturi tipici ca distinguunu li celluli immunitari e li populazziuni di celluli tumorali (tabbella S2 e figura S1A). St'analisi mustràu ca rispettu ê celluli T, l'asciti e li celluli tumorali hannu livelli d'assunziuni di glucosiu cchiù jauti, ma hannu diffirenzi cchiù picciriḋḋi ntà l'attività mitucondriali. L'assorbimentu mediu di glucosiu dî celluli tumuriali [CD45-EpCAM (EpCAM)+] è di tri o quattru voti chiḋḋu dî celluli T e l'assunziuni media di glucosiu dî celluli T CD4 + è 1,2 voti chiḋḋa dî celluli T CD8 +, ca innica ca li linfociti infiltranti dû tumuri ntà li celluli tumorali (TIL) hannu li TME metabbolici diffirenti). Ô cuntrariu, l'attività mitucondriali nté celluli tumuriali è simili a chiḋḋa dî celluli CD4 + T e l'attività mitucondriali di tutti dui li tipi di celluli è cchiù jauta di chiḋḋa dî celluli CD8 + T (Figura 1B). In ginirali, sti risultati rivelanu lu livellu metabolicu. L'attività metabolica dî celluli tumurali è cchiù jauta di chiḋḋa dî celluli CD4 + T e l'attività metabolica dî celluli CD4 + T è cchiù jauta di chiḋḋa dî celluli CD8 + T. Nustanti st'effetti ntà tutti li tipi di celluli, non c'è na diffirenza coirenti ntò statu metabolicu dî celluli T CD4+ e CD8+ o li sò prupurziuni rilativi ntà l'asciti rispettu ê tumuri (Figura 1C). Ô cuntrariu, ntà frazziuni dî celluli CD45, la prupurziuni di celluli EpCAM+ ntò tumuri aumintau rispettu all'asciti (Figura 1D). Ossirvamu puru na chiara diffirenza metabolica tra li cumpunenti dî celluli EpCAM+ e EpCAM. Li celluli EpCAM+ (tumuri) hannu n'assunziuni di glucosiu e n'attività mitucondriali cchiù jauta rispettu ê celluli EpCAM, ca è assà cchiù jauta di l'attività metabolica dî fibbroblasti nté celluli tumuriali ntà TME (Figura 1, E e F).
(A e B) Intinsità mediana di fluuriscenza (IMM) di l'assunziuni di glucosiu (2-NBDG) (A) e attività mitucundriali dî celluli CD4 + T (MitoTracker russu scuru) (B) Grafici rapprisintanti (a manu manca) e dati tabbulati (a manu dritta), li celluli CD8 + T e li celluli tumuri EpCAM + CD45-. (C) Lu rapportu dî celluli CD4 + e CD8 + (di celluli CD3 + T) ntà l'asciti e lu tumuri. (D) Prupurziuni di cèlluli tumuriali EpCAM + ntà l'asciti e lu tumuri (CD45-). (E e F) Assorbimentu dû glucosiu dâ matrici EpCAM + CD45 e EpCAM-CD45 (2-NBDG) (E) e attività mitucundriali (russu scuru MitoTracker) (F) gràfici rapprisintanti (a manca) e dati tabbulati (a dritta) Asciti e cèlluli dû tumuri. (G) Grafici rapprisintanti di l'esprissiuni CD25, CD137 e PD1 câ citumetria a flussu. (H e I) l'esprissiuni CD25, CD137 e PD1 ntà li celluli T CD4 + (H) e li celluli T CD8 + (I). (J e K) Finutipi ingenui, mimoria cintrali (Tcm), effetturi (Teff) e mimoria effetturi (Tem) basati ntà l'esprissiuni di CCR7 e CD45RO. Immaggini rapprisintanti (a manca) e dati tabbulari (a dritta) dî celluli T CD4 + (J) e celluli T CD8 + (K) ntà l'asciti e li tumuri. Li valùri ri P additirminati dô test t accuppiatu (*P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001). A lìnia rapprisenta li pazienti abbinati (n = 6). FMO, fluuriscenza menu unu; MFI, ntinsità media dâ fluuriscenza.
Ulteriori analisi rivilaru autri diffirenzi significativi tra lu statu finutipicu dâ cellula T assà risoltu. La mimoria attivata (Figura 1, G a I) e effettrici (Figura 1, J e K) nté tumuri sunnu assà cchiù friquenti di l'asciti (ppurpurziuni di celluli CD3 + T). Â stissa manera, analizzari lu finutipu cu l'esprissiuni dî marcaturi d'attivazziuni (CD25 e CD137) e li marcaturi d'impoverimentu [pruteina dâ morti cellulari prugrammata 1 (PD1)] mustraru ca puru si li caratteristichi metabbolici di sti populazziuni sunnu diversi (Figura S1, B nzinu a E) , Ma nuḋḋu effettu metabbolicu significativu ossirvatu custantimenti (Figura S1). F a I). Sti risultati foru cunfirmati usannu mètudi di apprinnimentu automàticu pi assignari automaticamenti li finutipi cellulari (21), ca rivilaru ultiriurmenti la prisenza di nu granni nummuru di celluli dû midollu ossiu (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) ntà l'asciti dû pazzienti (Figura S2A). Ntra tutti li tipi di celluli identificati, sta populazziuni cellulari mieloidi mustrau l'assunziuni di glucosiu e l'attività mitucondriali cchiù jauta (Figura S2, B nzinu a G). Sti risultati suttalineunu li forti diffirenzi metabolichi tra li tipi di celluli multipli ca s'attrovunu ntà l'asciti e li tumuri nté pazzienti cu HGSC.
La sfida principali pi capiri li carattirìstichi metabbunòmichi dâ TIL è la necessità di isulari campioni di cèlluli T di purità, qualità e quantità sufficienti dî tumuri. Studi ricenti mustraru ca li mètudi di urdinamentu e arricchimentu dî perli basati ntà citumetria a flussu ponnu purtari a canciamenti ntà li prufili dî metabboliti cellulari (22-24). Pi affruntari stu prubblema, uttimizzamu lu mètudu d'arricchimentu dî pirlini pi isulari e isulari lu TIL dû càncaru ovaricu umanu ricivutu chirurgicamenti prima di l'analisi cu LC-MS/MS (vidi Matiriali e Mètudi; Figura 2A). Pî valutari l'impattu cumplessivu di stu protocollu nté canciamenti dî metabboliti, cunfruntamu li prufili metabboliti dî celluli T attivati ​​dî dunaturi sani doppu lu passaggiu di siparazziuni dî perli supra cu li celluli ca non èrunu siparati dî perli ma ristaru ntò ghiacciu. Chista analisi dû cuntrollu dâ qualità attruvau ca c'è n'auta currelazziuni tra sti du cunnizziuni (r = 0,77) e la ripitibbilità tecnica dû gruppu di 86 metabboliti avi n'auta ripitibbilità (Figura 2B). Pirciò, sti mètudi ponnu fari n'analisi accurata dî metabboliti nté celluli ca suffrunu l'arricchimentu dû tipu cellulari, dunannu accussì la prima piattaforma a risuluzziuni auta pi identificari metabboliti spicifici ntà HGSC, pirmittennu accussì ê genti di capiri cchiù prufunnamenti la spicificità cellulari dû prugramma dû metabbulismu sissuali.
(A) Schema schematicu di l’arricchimentu di perli magnètichi. Prima di l'analisi cu LC-MS/MS, li cèlluli subbisciunu tri giru cunzicutivi di arricchimentu di perli magnètichi o arristaru ncapu lu ghiacciu. (B) L'effettu dû tipu d'arricchimentu ntà l'abbunnanza dî metabboliti. La media di tri misurazzioni pi ogni tipu d'arricchimentu ± SE. La linia grigia riprisenta na rilazzioni 1:1. A currilazzioni ‘ntra classi (ICC) ri misurazzioni ripituti mustrata nnâ etichetta dû assi. NAD, dinucliotidi di l'adinina di nicutinamida. (C) Schema schematicu dû flussu di travagghiu di l'analisi dî metabboliti dû pazzienti. L'asciti o li tumuri vennu arricugghiuti dî pazzienti e criucunsirvati. Na parti nica ri ogni campioni fu analizzata câ citometria a flussu, mentri li campioni ristanti subbìru tri giru ri arricchimentu pì celluli CD4+, CD8+ e CD45-. Sti frazziuna cillulari foru analizzati usannu LC-MS/MS. (D) Mappa di caluri di l'abbunnanza di metabboliti standardizzata. U dindrugramma rapprisenta u raggruppamentu ri distanzi euclidei ri Ward ntra li campioni. (E) Analisi dî cumpunenti principali (PCA) dâ mappa dî metabboliti dû campioni, ca mustra tri rèplichi ri ogni campioni, li campioni dû stissu pazienti sunnu culligati dâ 'na lìnia. (F) Lu PCA dû prufilu metabbolicu dû campioni cunnizziunatu supra lu pazienti (vali a ‘ddìri, usannu a ridunanza parziali); u tipu ri campioni è limitatu dô scafu cunvessu. PC1, cumpunenti principali 1; PC2, cumpunenti principali 2.
Successivamenti, applicamu stu mètudu d'arricchimentu pi analizzari 99 metabboliti ntà li frazziuni dî celluli CD4 +, CD8 + e CD45 ntà l'asciti primari e li tumuri di sei pazzienti HGSC (Figura 2C, Figura S3A e Tabella S3 e S4). La populazziuni di ntiressi rapprisenta dû 2% ô 70% dû campioni ranni urigginali di celluli viventi e la prupurzioni di celluli cancia assà ntra li pazzienti. Doppu ca si sipararu li perlini, la frazziuni arricchiuta di ntiressi (CD4+, CD8+ o CD45-) rapprisenta 'n media cchiù dû 85% di tutti li celluli viventi ntô campioni. Chistu mètudu ri arricchimentu ci cunzenti ri analizzari li populazzioni cellulari dô metabbulismu dî tissuti tumorali umani, ca è ‘mpossibbili fari cû campioni ranni. Usannu stu protocollu, additirminamu ca l-chinurenina e l'adinosina, sti du metabboliti immunusuppressivi ben caratterizzati èrunu aumintati ntà li celluli T dû tumuri o li celluli dû tumuri (Figura S3, B e C). Pirciò, sti risultati dimustranu la fidiltà e l'abbilità dâ nostra siparazziuni cellulari e la tecnuluggìa dâ spettrumetria di massa pi truvari metabboliti biuloggicamenti mpurtanti nté tissuti dî pazzienti.
La nostra analisi rivilàu puru na forti siparazziuni metabolica dî tipi di celluli dintra e tra li pazzienti (Figura 2D e Figura S4A). In particulari, rispettu all'autri pazzienti, lu pazzienti 70 mustrau caratteristichi metabolichi diversi (Figura 2E e Figura S4B), ca innica ca pò essiri n'eterogginità metabolica sustanziali tra li pazzienti. Si va a nutari ca rispettu a autri pazienti (1,2 a 2 litri; tabbella S1), la quantità totali di asciti arricugghiuta ntô pazienti 70 (80 ml) era cchiù nica. Lu cuntrollu di l'eterogginità interpazzienti duranti l'analisi dî cumpunenti principali (pir esempiu, usannu l'analisi di ridunanza parziali) mustra canciamenti coerenti tra li tipi di celluli e li tipi di celluli e/o lu micruambienti sunnu chiaramenti aggrigati secunnu lu profilu metabboliticu (Figura 2F). L'analisi dî singuli metabboliti enfatizzau st'effetti e rivilàu diffirenzi significativi tra li tipi di celluli e lu micruambienti. Si va a nutari câ diffirenza cchiù estrema ossirvata è lu MNA, ca di solitu è ​​arricchitu nté celluli CD45- e nté celluli CD4+ e CD8+ ca infiltranu ntò tumuri (Figura 3A). Pi li celluli CD4+, st'effettu è cchiù chiaru e l'MNA nté celluli CD8+ pari essiri puru fortimenti nfruenzatu di l'ambienti. Com'è gghiè, chistu nun è mpurtanti picchì sulu tri dî sei pazzienti ponnu èssiri valutati pî punteggi CD8+ dû tumuri. Ortri ô MNA, ntà diversi tipi di celluli ntà l'asciti e li tumuri, autri metabboliti ca sunnu caratterizzati picca ntà TIL sunnu puru ricchi diffirinziarmenti (Figuri S3 e S4). Pirciò, sti dati rivelanu nu nzemi prumittenti di metabboliti immunumodulaturi pi ultiriuri ricerchi.
(A) Cuntinutu nurmalizzatu di MNA ntà li celluli CD4+, CD8+ e CD45- di l'asciti e dû tumuri. Lu gràficu dâ scatula mustra la midiana (linia), l'intervallu ntirquartili (cerniera dû quatru) e l'intervallu di dati, nzinu a 1,5 voti l'intervallu ntirquartili (barba dû quatru). Comu discrittu nnî Matiriali e Mètudi dû Pazienti, usari u valuri limma dû pazienti pì additirminàri u valuri P (*P<0,05 e **P<0,01). (B) Schema schematicu dû metabbulismu dû MNA (60). Li metabboliti: S-adinusil-1-mitionina; SAH, S-adinusina-1-omucisteina; NA, nicutinamida; MNA, 1-mitilnicutinamida; 2-PY, 1-mitil- 2-piriduna-5-carbussamida; 4-PY, 1-mitil-4-piriduna-5-carbussamida; NR, ribosa di nicutinamida; NMN, monunucliotidi di nicutinamida. Enzimi (virdi): NNMT, N-mitiltransfirasi dâ nicutinamida; SIRT, sirtuini; NAMPT, nicutinamida fosfuribbusili trasfirasi; AOX1, aldiidi ossidasi 1; NRK, chinasi dû ribbosidu dâ nicutinamida; NMNAT, nicutinamida monu nucliotidicu trasfirasi di l'adinilatu; Pnp1, fosfurilasi nucliusida purina. (C) t-SNE dû scRNA-seq di l'asciti (grigiu) e dû tumuri (russu; n = 3 pazzienti). (D) L'esprissiuni NNMT ntà populazziuni cellulari diversi idintificati usannu lu scRNA-seq. (E) Esprissiuni di NNMT e AOX1 ntà SK-OV-3, rini mbrionicu umanu (HEK) 293T, cèlluli T e cèlluli T trattati cu MNA. L'esprissiuni arripiegata è mustrata rispettu a SK-OV-3. Vistu lu schema d'esprissiuni cû SEM (n = 6 dunatura sani). Li valura di Ct cchiù granni di 35 su’ cunzidirati nun rilivàbbili (UD). (F) Esprissiuni di SLC22A1 e SLC22A2 ntà SK-OV-3, HEK293T, cèlluli T e cèlluli T trattati cu MNA 8 mM. L'esprissiuni arripiegata è mustrata rispettu a SK-OV-3. Vistu lu schema d'esprissiuni cû SEM (n = 6 dunatura sani). Li valura di Ct cchiù granni di 35 su’ cunzidirati nun rilivàbbili (UD). (G) Cuntinutu di MNA cillulari nne cèlluli T dunaturi sani attivati ​​doppu 72 uri d'incubazziuni cu MNA. Vistu lu schema d'esprissiuni cû SEM (n = 4 dunatura sani).
Lu MNA è pruduttu trasfirennu lu gruppu mitilicu di S-adinusil-1-mitionina (SAM) â nicutinamida (NA) dâ nicutinamida N-mitiltransfirasi (NNMT; Figura 3B). Lu NNMT è suvraespressu ntà na varietà di tumori umani e è assuciatu â prulifirazziuni, nvasiuni e metàstasi (25-27). Pi capiri megghiu la funti di MNA ntà li celluli T ntà TME, usamu scRNA-seq pi carattirizzari l'esprissiuni di NNMT ntà tutti li tipi di celluli ntà l'asciti e li tumuri di tri pazzienti HGSC (tabbella S5). L'analisi di circa 6.500 celluli mustràu ca ntà l'ambienti di l'asciti e dû tumuri, l'esprissiuni NNMT era ristritta ê prisunti populazziuni di fibbroblasti e celluli tumuriali (Figura 3, C e D). Si va a nutari ca non c'è n'esprissiuni ovvia di NNMT ntà nuḋḋa populazziuni ca esprimi lu PTPRC (CD45 +) (Figura 3D e Figura S5A), ca innica ca l'MNA rilivatu ntà lu spettru dî metabboliti fu introduttu ntà li celluli T. L'esprissiuni di l'aldeidi ossidasi 1 (AOX1) cummirtuti lu MNA ntà 1-mitil-2-piriduna-5-carbussamida (2-PYR) o 1-mitil-4-piriduna-5-carbussamida (4-PYR); La figura 3B) è puru ristritta â populazziuni dî fibbroblasti ca esprimunu COL1A1 (Figura S5A), ca nzemmula innicanu ca li celluli T nun hannu l'abbilità dû metabbulismu MNA cumminziunali. Lu schema d'esprissiuni di sti geni ligati ô MNA fu virìficatu usannu nu sicunnu nzemi di dati cellulari innipinnenti di l'asciti dî pazzienti cu HGSC (Figura S5B; n = 6) (16). Sparti, l'analisi dâ riazziuni a catina dâ polimirasi quantitativa (qPCR) dî celluli T dunaturi sani trattati cu MNA mustrò ca rispettu ê celluli tumorali ovariani SK-OV-3 di cuntrollu, NNMT o AOX1 quasi non èrunu espressi (Figura 3E). Sti risultati inaspittati innicanu ca lu MNA pò essiri secretu dî fibbroblasti o dî tumuri ntà li celluli T adiacenti ntà TME.
Puru si li cannidati nchiùjinu la famigghia di traspurtaturi di catiuni urganici 1 a 3 (OCT1, OCT2 e OCT3) cudificati dâ famigghia dû purtaturi sulùbbili 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 e SLC22A3), li traspurtaturi putinziali di MNA sunnu ancora nun difiniti (28). Lu QPCR di mRNA di cèlluli T dunaturi sani mustrau liveḍḍi d'esprissiuni vasci di SLC22A1 ma liveḍḍi nun rilivàbbili di SLC22A2, ca cunfirmaru ca avìa statu ripurtatu prima ntà littiratura (Figura 3F) (29). Ô cuntrariu, la linia cellulari dû tumuri ovarianu SK-OV-3 esprimìu liveḋḋi auti di tutti dui li traspurtaturi (Figura 3F).
Pi pruvari si li cèlluli T ponnu assuppari MNA furasteri, li cèlluli T dunaturi sani foru curtivati ​​pi 72 uri 'n prisenza di cuncintrazziuni diversi di MNA. Ntà l'assenza di MNA esugenu, lu cuntinutu cellulari di MNA non pò essiri rilivatu (Figura 3G). Com'è gghiè, li celluli T attivati ​​trattati cu MNA esugeni mustraru n'aumentu dipinnenti dâ dosi ntò cuntinutu di MNA ntà li celluli, nzinu a 6 mM MNA (Figura 3G). Chistu risultatu innica ca nunustanti lu livellu vasciu d'esprissiuni traspurtaturi e la mancanza di l'enzima principali rispunsabbili dû metabbulismu intracellulari dû MNA, lu TIL pò ancora pigghiari lu MNA.
Lu spettru dî metabboliti ntà li celluli T dî pazzienti e li spirimenti d'assorbimentu di MNA in vitro aumentunu la pussibbilità ca li fibbroblasti assuciati ô cancru (CAF) secretunu MNA e li celluli tumorali ponnu rigulari lu finutipu e la funziuni dâ TIL. Pi additirminari l'effettu dû MNA ncapu li cèlluli T, li cèlluli T dunaturi sani foru attivati ​​in vitro 'n prisenza o assenza di MNA e la sò prolifirazziuni e la produzziuni di citucini furu valutati. Doppu 7 jorna di junciri MNA â dosi cchiù auta, lu nùmmaru di raddoppiu dâ populazziuni fu mudiratamenti riduttu, mentri lu vigori fu mantinutu a tutti li dosi (Figura 4A). Sparti, lu trattamentu di l'MNA esugeni purtau a n'aumentu dâ prupurziuni di celluli T CD4 + e CD8 + ca esprimunu lu fatturi di nicrusi tumorali-α (TNFα; Figura 4B). Ô cuntrariu, la produzziuni intracellulari di IFN-γ fu ridutta assà nté celluli T CD4 +, ma non nté celluli T CD8 + e non ci fu nuḋḋu canciamentu significativu ntà l'interleuchina 2 (IL-2; Figura 4, C e D). Pirciò, lu test immunusurbenti ligatu a l'enzimi (ELISA) dî supranatanti di sti culturi di cèlluli T trattati cu MNA mustrau n'aumentu significativu ntà TNFα, na diminuzziuni ntà IFN-γ e nuḋḋu canciamentu ntà IL-2 (Figura 4, E a G). . La diminuzziuni di l'IFN-γ innica ca lu MNA pò aviri nu rolu ntà l'inibbizziuni di l'attività antitumorali dî celluli T. Pi simulari l'effettu dû MNA ntà citutossicità mediata dî celluli T, li celluli dû ricipituri antìggini chimericu T (FRα-CAR-T) ca miranu ô ricipituri dû folatu α e CAR-T (GFP) rigulati dî celluli dâ prutiina fluoriscenti virdi (GFP) -CAR-T) sunnu prudutti dî celluli piriferichi dunaturi sani (monunuari di sangu PBMC). Li cèlluli CAR-T foru curturati pi 24 uri 'n prisenza di MNA e poi co-curturati cu cèlluli tumorali ovariani umani SK-OV-3 ca esprimunu lu ricipituri di folatu α a nu rapportu effetturi/birsagghiu di 10:1. Lu trattamentu cû MNA purtau a na diminuzziuni significativa di l'attività di morti dî celluli FRα-CAR-T, ca era simili ê celluli FRα-CAR-T trattati cu l'adinosina (Figura 4H).
(A) Cuntu totali di cèlluli vitali e raddoppiu dâ populazziuni (PD) direttamenti dâ curtura lu jornu 7. Lu gràficu a barri rapprisenta la media + SEM di sei dunatura sani. Rapprisenta li dati ri almìenu n = 3 spirimenti ‘nnipinnenti. (B a D) CD3/CD28 e IL-2 furu usati pi attivari li celluli T nté sò cuncintrazziuni rispittivi di MNA pi 7 jorna. Prima di l'analisi, li cèlluli foru stimulati cu PMA/ionomicina cu GolgiStop pi 4 uri. L'esprissiuni di TNFα (B) ntà li celluli T. Esempiu di l'immaggini (a manu manca) e li dati tabbulari (a manu dritta) di l'esprissiuni TNFα nté celluli viventi. L'esprissiuni di IFN-γ (C) e IL-2 (D) ntà li celluli T. L'esprissiuni dî citucini fu misurata câ citumetria a flussu. Lu gràficu a barri rapprisenta la media (n = 6 dunatura sani) + SEM. Usari l'analisi unidirezziunali dâ varianza e misuri ripituti (*P<0,05 e **P<0,01) pì additirminàri u valùri ri P. Rapprisenta li dati ri almìenu n = 3 spirimenti ‘nnipinnenti. (E a G) CD3/CD28 e IL-2 furu usati pi attivari li celluli T nté sò cuncintrazziuni rispittivi di MNA pi 7 jorna. Lu mediu fu arricugghiutu prima e doppu 4 uri di stimulazziuni PMA/ionomicina. Li cuncintrazziuni di TNFα (E), IFN-γ (F) e IL-2 (G) foru misurati cu ELISA. Lu gràficu a barri rapprisenta la media (n = 5 dunatura sani) + SEM. Lu valuri P additirminatu usannu l'analisi unidirezziunali dâ varianza e misurazzioni ripituti (*P<0,05). La linia punteggiata ìnnica lu limiti di rilevamentu dû rilevamentu. (H) Assay di lisi cillulari. Li cèlluli FRα-CAR-T o GFP-CAR-T foru ajustati cu l'adinosina (250 μM) o MNA (10 mM) pi 24 uri, o lassati senza trattamentu (Ctrl). Fu misurata la pircintuali di morti di cèlluli SK-OV-3. Lu valuri P additirminatu dô test t di Welch (*P<0,5 e **P<0,01).
Pî aviri na cumprinsiuni miccanica dâ rigulazziuni di l'esprissiuni TNFα dipinnenti dû MNA, li canciamenti ntà l'mRNA TNFα dî celluli T trattati cu MNA furu valutati (Figura 5A). Li cèlluli T dunaturi sani trattati cu MNA mustraru n'aumentu duppiu dî livelli di trascrizziuni TNFα, ca innica ca lu MNA dipenni dâ rigulazziuni trascrizziunali TNFα. Pi studiari stu pussibbili meccanismu rigulaturi, furu valutati du fatturi di trascrizziuni canusciuti ca regulunu lu TNFα, vali a diri lu fatturi nucliari dâ cellula T attivatu (NFAT) e la prutiina spicifica 1 (Sp1), comu risposta ô ligami MNA ô prumuturi TNFα prossimali ( 30 ). Lu prumuturi TNFα cunteni 6 siti di ligami NFAT identificati e 2 siti di ligami Sp1, ca si suvrapponnu ntà nu situ [-55 coppi di basi (bp) dû 5'cap] (30). L'immunupricipitazziuni dâ crumatina (ChIP) mustrò ca quannu fu trattatu cu MNA, lu ligami di Sp1 ô promoturi TNFα aumintau tri voti. Macari l'incorpurazzioni dû NFAT aumintò e s’avvicinò â ‘mpurtanza (Figura 5B). Sti dati innicanu ca lu MNA règula l'esprissiuni di TNFα attraversu la trascrizziuni Sp1 e 'n misura cchiù nica l'esprissiuni di NFAT.
(A) Paragunatu ê celluli T curturati senza MNA, lu canciamentu dâ piega di l'esprissiuni TNFα ntà li celluli T trattati cu MNA. Vistu lu schema d'esprissiuni cû SEM (n = 5 dunatura sani). Rapprisenta li dati ri almìenu n = 3 spirimenti ‘nnipinnenti. (B) Lu prumuturi TNFα dî cèlluli T trattati cu o senza 8 mM MNA doppu ca NFAT e Sp1 foru cumminati cu (Ctrl) e stimulazziuni PMA/ionomicina pi 4 uri. L'immunuglubbulina G (IgG) e H3 foru usati comu cuntrolli nigativi e positivi pi l'immunupricipitazziuni, rispittivamenti. La quantificazziuni dû ChIP mustrò ca lu ligami di Sp1 e NFAT ô promoturi TNFα ntê cèlluli trattati cu MNA aumintau assài voti rispettu ô cuntrollu. Rapprisenta li dati ri almìenu n = 3 spirimenti ‘nnipinnenti. Lu valuri P additirminatu di cchiù test t (*** P <0,01). (C) Rispettu all'asciti di HGSC, li celluli T (non citutossici) mustraru n'esprissiuni aumintata di TNF ntò tumuri. Li culura rapprisentunu pazienti diversi. Li cèlluli mustrati foru campiunati a casu nzinu a 300 e jitterati pi limitari lu disegnu supratuttu (** Padj = 0,0076). (D) Mudeḍḍu prupostu di MNA pû càncaru di l’ovari. Lu MNA è pruduttu ntà li celluli tumurali e li fibbrobblasti ntà TME e è assuntu dî celluli T. Lu MNA aumenta lu ligami di Sp1 ô promoturi TNFα, purtannu a n'aumentu dâ trascrizziuni TNFα e la produzziuni di citucini TNFα. Lu MNA causa puru na diminuzziuni di l'IFN-γ. L'inibbizziuni dâ funziuni dî celluli T porta a na riduzziuni di l'abbilità d'uccidiri e na criscita accilirata dû tumuri.
Secunnu li riporti, lu TNFα avi effetti antitumorali e antitumorali dipinnenti davanti e arrè, ma avi nu rolu abbanniatu ntà prumuzziuni dâ criscita e dî metàstasi dû cancru a l'ovari (31-33). Secunnu li riporti, la cuncintrazziuni di TNFα ntà l'asciti e li tissuti tumorali nté pazzienti cu cancru a l'ovari è cchiù auta di chiḋḋa ntà li tissuti binigni (34-36). In termini di miccanismu, lu TNFα pò rigulari l'attivazziuni, la funziuni e la prulifirazziuni dî celluli janchi dû sangu e canciari lu finutipu dî celluli tumorali (37, 38). Coerenti cu sti risultati, l'analisi di l'esprissiuni ginètica diffirinziali mustrò ca lu TNF era assà rigulatu nté celluli T nté tissuti tumorali rispettu all'asciti (Figura 5C). L'aumentu di l'esprissiuni dû TNF fu evidenti sulu nté populazziuni di celluli T cu nu finutipu non citutossicu (Figura S5A). Comu riassuntu, sti dati supportunu l'opiniuni ca lu MNA avi effetti duppi immunusuppressivi e prumuturi di tumuri ntà HGSC.
L'etichettatura fluoriscenti basata ncapu la citumetria a flussu addivintau lu mètudu principali pi studiari lu metabbulismu TIL. Sti studi mustraru ca rispettu ê linfociti dû sangu pirifericu o ê celluli T di l'organi linfoidi sicunnari, li TIL murini e umani hannu na tinnenza cchiù jauta a assorbiri lu glucosiu (4, 39) e la perdita graduali dâ funziuni mitucondriali (19, 40). Puru si ossirvamu risultati simili ntà stu studiu, lu sviluppu chiavi è chiḍḍu di cunfruntari lu metabbulismu dî celluli tumurali e la TIL dû stissu tissutu tumurali risicatu. Coerenti cu certi di sti rilazziuni pricidenti, li celluli tumuriali (CD45-EpCAM +) di l'asciti e li tumuri hannu n'assunziuni di glucosiu cchiù jauta rispettu ê celluli T CD8 + e CD4 +, sustennu ca l'assunziuni jauta di glucosiu dî celluli tumuriali pò essiri paragunata ê celluli T. Lu cuncettu di cuncurrenza dî celluli T. TME. Com'è gghiè, l'attività mitucondriali dî celluli tumuriali è cchiù jauta di chiḋḋa dî celluli CD8 + T, ma l'attività mitucondriali è simili a chiḋḋa dî celluli CD4 + T. Sti risultati rafforzanu lu tema emergenti ca lu metabbulismu ossidativu è mpurtanti pî celluli tumorali (41, 42). Suggirisciunu puru ca li celluli T CD8+ ponnu essiri cchiù suscittìbbili â disfunziuni ossidativa rispettu ê celluli T CD4+, o ca li celluli T CD4+ ponnu usari funti di carboniu autri ca lu glucosiu pi mantèniri l'attività mitucondriali (43, 44). Si avissi a nutari ca non ossirvamu na diffirenza ntà l'assorbimentu dû glucosiu o l'attività mitucondriali tra l'effetturi CD4 + T, la mimoria effetturi T e li celluli dâ mimoria cintrali T ntà l'asciti. Â stissa manera, lu statu di diffirenziazziuni dî celluli T CD8 + nté tumuri nun avi nuḋḋu a chi fari cchî canciamenti ntà l'assorbimentu dû glucosiu, suttaliniannu la diffirenza significativa tra li celluli T curtivati ​​in vitro e la TIL umana in vivo (22). Sti osservazziuni furu cunfirmati puru di l'usu di l'allocazziuni automatica imparziali dâ populazziuni cellulari, ca rivilàu ultiriurmenti ca li celluli CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + cu n'assunziuni di glucosiu e n'attività mitucondriali cchiù jauta rispettu ê celluli tumuriali sunnu privalenti ma hannu na populazziuni cellulari attiva metabbolica. Sta populazziuni pò rapprisintari la suttapupulazziuni putativa di celluli suppressuri mieloidi o celluli dindritici plasmacitoidi identificati ntà l'analisi scRNA-seq. Puru si tutti dui furu ripurtati nté tumuri ovariani umani [45], hannu ancora bisognu di autri travagghi pi discrìviri sta suttapupulazziuni mieloidi.
Puru si li mètudi basati ntà citumetria a flussu ponnu chiariri li diffirenzi ginirali ntà lu glucosiu e lu metabbulismu ossidativu tra li tipi di celluli, li metabboliti pricisi prudutti dû glucosiu o autri funti di carboniu pò metabbulismu mitucondriali ntà TME non furu ancora ditirminati. Assignari la prisenza o l'assenza dî metabboliti a nu certu suttanzemi TIL richiedi la purificazziuni dâ populazziuni cellulari dû tissutu escisu. Pirciò, lu nostru mètudu d'arricchimentu cellulari cumminatu câ spettrumetria di massa pò dari nfurmazzioni ncapu li metabboliti ca sunnu arricchiuti diffirinziarmenti ntê celluli T e ntê populazziuni cellulari tumorali ntê campioni di pazzienti abbinati. Puru si stu metudu avi vantaggi rispettu â scelta cellulari attivata dâ fluuriscenza, certi bibbliutechi di metabboliti ponnu essiri nfruenzati a causa dâ stabbilità inerenti e/o nu tassu di fatturatu rapidu (22). Tuttavia, u nostru mètudu riniscìu a ‘dintificari dui metabboliti immunusuppressivi ricanusciuti, l'adenosina e a chinurenina, picchì càncianu assái ntra li tipi ri campioni.
La nostra analisi metabbunomica dî tumuri e dî suttatipi TIL duna cchiù nfurmazziuni supra lu rolu dî metabboliti ntà TME ovariana. Prima, usannu la citumetria a flussu, additirminamu ca non c'era na diffirenza ntà l'attività mitucondriali tra li tumuri e li celluli CD4 + T. Com'è gghiè, l'analisi LC-MS/MS rivilàu canciamenti significativi ntà l'abbunnanza dî metabboliti ntà sti populazziuni, ca innica ca li conclusioni supra lu metabbulismu TIL e la sò attività metabolica cumplissiva richiedunu n'attenta ntirpritazziuni. Comu secunna cosa, lu MNA è lu metabbolitu câ diffirenza cchiù granni tra li celluli CD45 e li celluli T ntà l'asciti, non li tumuri. Pirciò, la cumpartimintazziuni e la pusizziuni dû tumuri ponnu aviri effetti diffirenti ntò metabbulismu TIL, ca suttalinia la pussibbili eterogginità ntà nu certu micruambienti. Terzu, l'esprissiuni di l'enzima ca produci MNA NNMT è principarmenti limitata â CAF, ca sunnu li celluli tumorali ntà na misura cchiù picciriḋḋa, ma li livelli di MNA rilivàbbili sunnu ossirvati ntà li celluli T dirivati ​​dû tumuri. La suvraesprissiuni di NNMT ntà CAF ovariana avi n'effettu canusciutu ca prumovi lu cancru, in parti a causa dâ prumuzziuni dû metabbulismu dâ CAF, l'invasiuni dû tumuri e li metàstasi (27). Puru si lu livellu cumplessivu di TIL è mudiratu, l'esprissiuni di NNMT ntà CAF è strittamenti currilata ô suttatipu misinchimali di l'Atlante dû ginoma dû cancru (TCGA), ca è assuciatu a na prugnosticu scarsa (27, 46, 47). Â fini, l'esprissiuni di l'enzima AOX1 respunsabbili dâ digradazziuni dû MNA è puru limitata â populazziuni CAF, ca innica ca li celluli T nun hannu l'abbilità di metabbulizzari lu MNA. Sti risultati supportunu l'idia ca puru si è nicissariu cchiù travagghiu pi virìficari chistu ritrovamentu, livelli auti di MNA ntà li celluli T ponnu innicari la prisenza di nu micruambienti CAF immunusuppressivu.
Vistu lu livellu d'esprissiuni vasciu dî traspurtaturi MNA e li livelli non rilivàbbili dî proteini chiavi coinvolti ntò metabbulismu dû MNA, la prisenza dû MNA nté celluli T è inaspittata. Né NNMT né AOX1 putìanu èssiri rilivati ​​cû l'analisi scRNA-seq e cû qPCR miratu ri du’ coorti ‘nnipinnenti. Sti risultati innicanu ca lu MNA non è sintitizzatu dî celluli T, ma assurbutu dû TME circustanti. Li spirimenti in vitro mustranu ca li celluli T tennunu a accumulari MNA esugenu.
Li nostri studi in vitro mustraru ca lu MNA esogenu pruvuca l'esprissiuni di TNFα ntê cèlluli T e aumenta lu ligami di Sp1 ô promoturi TNFα. Puru si lu TNFα avi sia funziuni antitumorali ca antitumorali, ntò cancru a l'ovari, lu TNFα pò prumòviri la criscita dû cancru a l'ovari (31-33). La niutralizzazziuni dû TNFα ntà cultura dî celluli dû tumuri ovarianu o l'eliminazziuni dû signali TNFα nté mudelli di surci pò migghiurari la produzziuni di citucini infiammatori mediati dô TNFα e inibbiri la criscita dû tumuri (32, 35). Pirciò, ntà stu casu, lu MNA dirivatu dû TME pò aggiri comu metabbolitu pro-infiammatoriu attraversu nu miccanismu dipinnenti dû TNFα attraversu lu ciclu autocrinu, prumuvennu accussì la cumparsa e la diffusiuni dû cancru a l'ovari (31). Basatu ncapu chista pussibbilità, lu bloccu TNFα è studiatu comu agenti terapeuticu putinziali pû cancru a l'ovari (37, 48, 49). Sparti, lu MNA riduci la citutossicità dî celluli CAR-T ê celluli tumorali ovariani, dannu autri provi dâ suppressiuni immunitaria mediata dô MNA. Nsemmula, sti risultati suggirisciunu nu mudellu aunni li tumuri e li celluli CAF ammuccianu MNA ntà TME extracellulari. Attraversu (i) la stimulazziuni dâ criscita dû cancru a l'ovari indutta dô TNF e (ii) l'inibbizziuni di l'attività citutossica dî celluli T indutta dô MNA, chistu pò aviri n'effettu tumorali duppiu (Figura 5D).
Pi concludiri, applicannu na cumminazziuni d'arricchimentu cellulari rapidu, siquenziamentu cellulari singulu e profilazziuni metabolica, stu studiu rivilàu li diffirenzi immunumetabbòmichi enormi tra li tumuri e li celluli di l'asciti nté pazzienti cu HGSC. St'analisi cumpleta mustràu ca ci sunnu diffirenzi ntà l'assorbimentu dû glucosiu e l'attività mitucondriali tra li celluli T e idintificau lu MNA comu nu metabbolitu rigulaturi immunitariu autònumu non cellulari. Chisti dati hannu n’impattu ncapu comu lu TME nfruenza lu metabbulismu dî cèlluli T ntô càncaru umanu. Puru si fu ripurtata la cuncurrenza diretta pî nutrienti tra li celluli T e li celluli tumorali, li metabboliti ponnu puru agiri comu rigulaturi indiretti pi prumoviri la prugrissiuni dû tumuri e possibbilmenti supprimiri li risposti immunitari endogeni. L'autra discrizziuni dû rolu funziunali di sti metabboliti rigulaturi pò apriri stratiggìi alternativi pi migghiurari la risposta immunitaria antitumorali.
Li campioni dî pazzienti e li dati clìnici foru uttinuti ntraversu lu ripositoriu dî tissuti dû càncaru BC cirtificatu dâ Riti Canadisi dû Ripositoriu dî Tissuti. Secunnu lu protocollu appruvatu dô Comitatu Eticu dâ Ricerca supra lu Cancru BC e dâ Univirsitati dâ Columbia Britannica (H07-00463), tutti li campioni e li dati clìnici dî pazienti ottèniru lu cunsensu scrittu ‘nformatu o rinunciaru furmalmenti ô sò cunsensu. Li campioni sunnu sarbati nnâ Biubanca cirtificata (BRC-00290). Li carattirìstichi dittagghiati dû pazienti sunnu mustrati ntê tabbelli S1 e S5. Pâ criucunsirvazzioni, nu bisturi veni usatu pi scumponiri meccanicamenti lu campioni dû tumuri dû pazzienti e poi spìnnirilu attraversu nu filtru di 100 micruni pi ottèniri na suspinsioni cellulari sìngula. L'asciti dû pazzienti fu centrifugata a 1500 rpm pi 10 minuti a 4°C pi pellettari li cèlluli e livari lu supranatanti. Li cèlluli uttinuti dû tumuri e di l'asciti foru criucunsirvati ntô 50% di sirumu AB umanu inattivatu dû caluri (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) e 10% di surfussidu di dimitili. Sti suspinsiuni di celluli singuli prisirvati furu sciogghiuti e usati pâ metabbulumica e la ditirminazziuni dî metabboliti discritti sutta.
Lu menzu cumpletu è furmatu di 0,22 μm filtrati 50:50 ntigrati RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2,05 mM l-glutamina (Termo Fisher Scientific) ntigratu cu 10% di sirumu AB umanu inattivatu dû caluri (Sigma-Aldrich), 12,5 mM Hepes (Termo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamina (Termo Fisher Scientific) Suluzzioni di strittumicina (PenStrep) e 50 μMB di mircaptuetanolu. AimV (Invitrogen) è ntigratu cu 20 mM di Hepes (Scientifica Termo Fisher) e 2 mM di l-glutamina (Scientifica Termo Fisher). Lu tampuni di culurazzioni dû citòmitru a flussu era fattu di 0,22 μm di salina tampunizzata cu fusfatu filtrata (PBS; Invitrogen) ntigrata cû 3% di sirumu umanu AB inattivatu dû caluri (Sigma). Lu tampuni d'arricchimentu cillulari è cumpostu di PBS filtratu di 0,22 μm e ntigratu cu sirumu AB umanu inattivatu dû caluri ô 0,5% (Sigma-Aldrich).
Nta nu menzu cumpletu a 37°C, li cèlluli foru culurati cu 10 nM MT DR e 100 μM 2-NBDG pi 30 minuti. Appoi, li cèlluli foru culurati cû culuranti di viabbilità eF506 a 4°C pi 15 minuti. Risuspenniri li cèlluli nnô Bloccu FC (eBioscience) e nnô Tampuni di Cultura Brillanti (BD Biosciences), dilujari nnô tampuni di culurazzioni dû citòmitru a flussu (sicunnu li istruzzioni dû prudutturi), e ncubari pi 10 minuti a timpiratura ambienti. Culurari li cèlluli cu nu nzemi di anticorpi (tabbella S2) ntô tampuni di culurazzioni dâ citumetria a flussu a 4°C pi 20 minuti. Risuspinnìri li cèlluli nnô tampuni di culurazzioni dâ citumitrìa a flussu (Cytek Aurora; cunfigurazzioni 3L-16V-14B-8R) prima di l'analisi. Usa SpectroFlo e FlowJo V10 pi analizzari li dati dû nùmmaru di cèlluli, e usa GraphPad Prism 8 pi criari li dati. La ntinsità mediana di fluuriscenza (MFI) di 2-NBDG e MT DR fu log-nurmalizzata e quinni fu usatu nu test t accuppiatu pi l'analisi statistica pi tèniri cuntu dî pazzienti abbinati. Rimuovi tutti li populazzioni cu cchiù picca ri 40 eventi dâ analisi; ‘nsìriri un valuri MFI ri 1 pì qualegghiè valuri nigatìvu prima ri eseguiri n’anàlisi statìstica e a visualizzazzioni dî dati.
Pî ntigrari la stratiggìa di gating manuali dû panneḍḍu di prucessu supra, usamu l'annutazzioni cumpleta di l'arvuru di ristrizzioni di furma (FAUST) (21) pi assignari autumàticamenti li cèlluli â pupulazzioni doppu ca livamu li cèlluli morti nna FlowJo. Gestimu manualmenti l'output pi junciri li populazziuni ca pari ca sunnu sbagghiati (cumminannu PD1+ cchî celluli tumorali PD1) e li populazziuni mantinuti. Ogni campioni cunteni ‘na media ri cchiù dû 2% ri cèlluli, pì nu totali ri 11 populazzioni.
La centrifugazzioni a dinsità dû gradienti di ficoll fu usata pi siparari lu PBMC dî prudutti di siparazzioni dî leucociti (Tecnuluggìi STEMCELL). Li cèlluli CD8 + T foru isulati dû PBMC usannu li microperli CD8 (Miltenyi) e allargati ntô menzu cumpletu usannu TransAct (Miltenyi) pi 2 simani sicunnu li istruzziuni dû prudutturi. Li cèlluli foru lassati stari pi 5 jorna nta nu menzu cumpletu ca cuntinìa IL-7 (10 ng/ml; PeproTech) e poi ristimulati cu TransAct. Lu jornu 7, secunnu li istruzziuni dû prudutturi, li microperli CD45 umani (Miltenyi) foru usati pi arricchiri li cèlluli nta tri giru cunzicutivi. Li cèlluli foru aliquotati pi l'analisi dâ citumetria a flussu (comu discrittu supra), e nu miliuni di cèlluli foru aliquotati tri voti pi l'analisi LC-MS/MS. Li campioni foru prucissati cû LC-MS/MS comu discrittu sutta. Stimamu lu valuri dû metabboliti mancanti cu nu nummuru di joni di 1.000. Ogni campioni veni nurmalizzatu dû nùmmaru totali ri joni (TIC), cummirtutu ‘n manera lugaritmica e nurmalizzatu ‘n manera autumàtica ‘n MetaboAnalystR prima dâ analisi.
La suspinsioni cellulari sìngula di ogni pazzienti fu sciogghiuta e filtrata attraversu nu filtru di 40 μm ntô menzu cumpletu (comu discrittu supra). Secunnu lu protocollu dû prudutturi, tri giru cunzicutivi di silizziuni positiva câ siparazziuni dî perli magnètici usannu MicroBeads (Miltenyi) furu usati pi arricchiri li campioni pî celluli CD8+, CD4+ e CD45- (ntô ghiacciu). In brevi, li celluli sunnu risuspinnuti ntà nu tampuni d'arricchimentu cellulari (comu discrivutu supra) e cuntati. Li cèlluli foru ncubati cu perli CD8 umani, perli CD4 umani o perli CD45 umani (Miltenyi) a 4°C pi 15 minuti e poi lavati cu nu tampuni d'arricchimentu cellulari. U campioni passa ‘ntraversu a culonna LS (Miltenyi) e li frazzioni positivi e nigatìvi sunnu arricugghiuti. Pì ridduciri la durata e massimizzari lu passaggiu di ricupiru cellulari, la frazziuni CD8 veni poi usata pò sicunnu giru d'arricchimentu CD4+ e la frazziuni CD4 veni usata pò succissivu arricchimentu CD45. Mantèniri la suluzzioni supra lu ghiacciu duranti tuttu lu prucessu di siparazzioni.
Pi priparàri li campioni pì l’analisi dî metabboliti, li cèlluli foru lavati 'na vota cû na suluzzioni ri sali fridda comu ghiacciu e 1 ml ri mitanolu ô 80% fu agghiuntu a ogni campioni, quinni vortexatu e cugghiutu ‘n azzotu liquidu. Li campioni foru suggetti a tri cicli ri ghiacciatu-sciogghimentu e centrifugati a 14.000 rpm pì 15 minuti a 4°C. Lu supranatanti ca cunteni li metabboliti s'evapura nzinu a quannu non si asciuga. Li metabboliti furu ridissolti ntà 50 μl di àcitu furmicu ô 0,03%, virtizzati pi ammiscari e poi centrifugati pi livari li detriti.
Estrarri li metabboliti comu discrivutu supra. Trasfiriri lu supranatanti nna na buttiglia di cromatografìa liquida a granni prissioni pâ ricerca metabbulumica. Usari nu protocollu ri trattamentu casuali pì trattari ogni campioni cû 'n nùmmaru sìmili ri cèlluli pì evitari effetti ri lottu. Ficimu na valutazziuni qualitativa dî metabboliti glubbali pubbricati prima ntô spettrumetru di massa triplu quadrupoli AB SCIEX QTRAP 5500 (50). L'analisi cromatugràfica e la ntigrazzioni di l'aria di piccu foru fatti usannu lu prugramma MultiQuant virsiuni 2.1 (Biusistemi Applicati SCIEX).
Nu nùmmaru ri joni ri 1000 fu usatu pì stimari u valùri ri metabboliti mancanti e u TIC ri ogni campioni fu usatu pì calculari l'aria ri piccu nurmalizzata ri ogni metabboliti rilevatu pì curriggiri li canciamenti ‘ntrodotti dâ analisi strumentali dâ elaborazzioni dû campioni. Doppu ca lu TIC veni nurmalizzatu, MetaboAnalystR(51) (paràmitru di basi) veni usatu pâ cummirsioni lugaritmica e la scalatura autumàtica dâ linia di norma. Usamu u PCA cû pacchettu R veganu pì eseguìri n’analisi esplorativa dî differenze ri metabbulomi ntra li tipi ri campioni e usamu n’analisi ri ridunanza parziali pì analizzari li pazienti. Usa u mètudu ri Ward pì custruiri 'n dindrugramma ri mappa ri caluri pì raggruppari a distanza euclidea ntra li campioni. Usamu lu limma (52) ntà l'abbunnanza dî metabboliti standardizzati pi identificari li metabboliti abbunnanti diffirinziarmenti ntà tuttu lu tipu di cellula e lu micruambienti. Pì simplificari a spiegazzioni, usamu u paràmitru dâ media dû gruppu pì spicificari u modellu e cunzidiràmu li tipi ri celluli nnô micruambienti comu ogni gruppu (n = 6 gruppi); pi lu test di significanza, fìcimu tri misurazziuni ripituti pi ogni metabbolitu Pì evitari na replicazziuni fausa, lu pazzienti fu nchiusu comu ostaculu ntô pruggettu dâ limma. Pî cuntrullari li diffirenzi nnî metabboliti ntra pazzienti diversi, ajustamu lu modellu limma inclusi li pazzienti ‘n manera fissa. Ripurtamu lu significatu dû cuntrastu pri-spicificatu ntra lu tipu di cellula e lu micruambienti di Padj <0,05 (currizziuni di Benjamini-Hochberg).
Doppu l'arricchimentu dû vigori usannu lu Kit di rimozzioni di cèlluli morti di Miltenyi (>80% di viabbilità), lu siquinziamentu dû trascrittuma a cèllula sìngula fu fattu ncapu l'asciti cugghiuti vivi e li campioni di tumuri usannu nu protocollu d'esprissiuni di geni 10x 5′. Furu analizzati cincu casi cu tumuri e asciti abbinati, puru si la vascia viabbilità di nu campioni di tumuri evitò la sò inclusioni. Pì ottèniri cchiù silizzioni ri pazienti, cumminamu li campioni ri ogni pazienti nnî corsi dû cuntrullaturi ri cromo 10x e analizzàmu li siti ri asciti e tumuri siparatamenti. Doppu lu siquinziamentu [Estrimità accuppiata di 28×98 bp (PE), ginoma dû Quebec; na media di 73.488 e 41.378 litturi pi cèllula pi tumuri e asciti rispittivamenti]], usamu CellSNP e Vireo (53) (basati ncapu CellSNP comu Lu SNP umanu cumuni (VCF) furnitu di GRCh38 è assignatu n'identità di ginutipu di dunaturi lu statu dû pazzienti closu (SNPRBS) (IBS), escludennu li cèlluli nun assignati e li cèlluli idintificati comu duplex e li dunaturi abbinati ntra campioni di asciti e tumuri (54), mantinimu tri casi cu na rapprisintanza abbunnanti di cèlluli ntô tumuri e l'asciti pi l'analisi a valli (scCoran pa5) pruduciu 6975 celluli (rispittivamenti 2792 e 4183 celluli di tumuri e asciti) pi l'analisi Usamu lu raggruppamentu di Louvain di l'igraph (57) dâ riti vicina cunnivisa cunnivisa (SNN) basata ntà distanza di Jaccard a li celluli di raggruppamentu cu l'esprissiuni marcata manualmenti. e visualizzati cu t-SNE li celluli T citutossici sunnu difiniti di l'esprissiuni di CD8A e GZMA, esclusi li suttagruppi cu n'esprissiuni pruteica vascia di Izar et al (16), inclusu la sò incorpurazziuni di l'esprissiuni tra celluli immunitari.
Li PBMC foru siparati dî prudutti di siparazzioni dî leucociti (tecnuluggìi STEMCELL) câ centrifugazzioni a dinsità gradienti di Ficoll. Li cèlluli CD3+ foru isulati dû PBMC usannu li perli CD3 (Miltenyi). Ntà prisenza o assenza di MNA, li celluli CD3+ furu attivati ​​cu CD3 ligatu ê placchi (5 μg/ml), CD28 solubbili (3 μg/ml) e IL-2 (300 U/ml; pruliuchina). Ntô ùrtimu jornu di l'espansiuni, la viabbilità (culuranti di viabbilità fissàbbili eFluor450, eBiuscienza) e la prulifirazzioni (123 cunti di perli e, Thermo Fisher Scientific) foru valutati câ citumitrìa a flussu. Valuta la funzioni effettrici stimulannu li cèlluli cu PMA (20 ng/ml) e jonumicina (1 μg/ml) cu GolgiStop pi 4 uri e monitorizzannu lu CD8-PerCP (RPA-T8, BioLiggenna), lu CD4-AF700 (RPA-T4), BioLiggenna) e la TNForiceticetiana. (MAb11, BD). Stimulari li cèlluli qPCR e ChIP cu PMA (20 ng/ml) e iunumicina (1 μg/ml) pi 4 uri. Lu supranatanti ELISA fu arricugghiutu prima e doppu la stimulazziuni cu PMA (20 ng/ml) e iunumicina (1 μg/ml) pi 4 uri.
Segui lu prutocollu dû prudutturi pi isulari l'RNA usannu lu Mini Kit RNeasy Plus (QIAGEN). Usa u trituraturi QIA (QIAGEN) pì omugginizzari u campioni. Usa lu kit di RNA a cDNA a granni capacità (Thermo Fisher Scientific) pi sintitizzari lu DNA cumplimintari (cDNA). Usa la miscela mastru avanzata rapida TaqMan (Thermo Fisher Scientific) pi quantificari l'esprissiuni ginètica (secunnu lu prutocollu dû prudutturi) cchî sunni appressu: Hs02786624_g1 [gliceraldiidi-3-fusfatu fora idrògginu (GAPDH)] e Hs01010726_m1 (SLC22A2). Li campioni foru eseguiti nnô sistema PCR ‘n tempu riali StepOnePlus (Biusistemi applicati) (Biusistemi applicati) nnâ placca ri riazzioni ottica viloci MicroAmp a 96 puzzu (Biusistemi applicati) cû film ottico MicroAmp. Quali chi fussi lu valuri di Ct ca supira lu 35, è cunzidiratu supra lu lìmiti di rilevamentu e è signatu comu nun rilivàbbili.
Eseguiri lu ChIP comu discrittu prima (58). ‘N brevi, li cèlluli foru trattati cu furmaldiidi (cuncintrazzioni finali 1,42%) e ncubati a timpiratura ambienti pi 10 minuti. Usari nu tampuni di tunnu supiriuri (25 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl e 0,1% NP-40) ntô ghiacciu pi 10 minuti, poi risuspinniri ntô tampuni di immunupricipitazzioni comu discrittu (58). U campioni fu quinni sunicatu cû li cicli seguenti: 10 cicli (20 impulsi ri 1 sicunnu) e nu tempu stàticu ri 40 sicunni. Ncubari l'anticorpi di l'immunuglubbulina G (tecnuluggìa di signalazziuni cillulari; 1μl), l'istuni H3 (tecnuluggìa di signalazziuni cillulari; 3μl), NFAT (Invitrògginu; 3μl) e SP1 (tecnuluggìa di signalazziuni cillulari; 3μl) cû campioni a 4°CCke. Ncubari li pirlini dâ prutiina A (Thermo Fisher Scientific) cû campioni a 4°C cu na scuppiata dilicata pi 1 ura, poi usari li pirlini di chelex (Bio-Rad) pi arricchiri lu DNA e usari la prutiinasi K (Thermo Fisher) pâ diggistiuni dî prutiini. Lu prumuturi TNFα fu truvatu cû PCR: avanti, GGG TAT CCT TGA TGC TGT; ô cuntrariu, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (pruduttu a 207 bp). Li mmàggini foru prudutti di Image Lab (Bio-Rad) e quantificati usannu lu prugramma ImageJ.
Lu supranatanti dâ curtura cillulari fu arricugghiutu comu discrittu supra. La ditirminazzioni fu fatta sicunnu li pruciduri dû prudutturi dû kit ELISA TNFα umanu (Invitrogen), lu kit ELISA IL-2 umanu (Invitrogen) e lu kit ELISA IFN-γ umanu (Abcam). Secunnu lu protocollu dû prudutturi, lu supranatanti fu dilujatu 1:100 pi truvari TNFα e IL-2 e 1:3 pi truvari IFN-γ. Usa lu litturi multietichetta EnVision 2104 (PerkinElmer) pi misurari l’assuppamentu a 450 nm.
Li PBMC foru siparati dî prudutti di siparazzioni dî leucociti (tecnuluggìi STEMCELL) câ centrifugazzioni a dinsità gradienti di Ficoll. Li cèlluli CD3+ foru isulati dû PBMC usannu li perli CD3 (Miltenyi). Ntà prisenza o assenza di MNA, li celluli CD3+ furu attivati ​​cu CD3 ligatu ê placchi (5 μg/ml), CD28 solubbili (3 μg/ml) e IL-2 (300 U/ml; pruliuchina) pi 3 jorna. Doppu 3 jorna, li cèlluli foru arricugghiuti e lavati cû 0,9% di salina e lu pellet fu cugghiutu sùbbutu. Lu cuntu di cèlluli fu fattu câ citumitrìa a flussu (Cytek Aurora; cunfigurazzioni 3L-16V-14B-8R) usannu 123 perli e-cuntu.
Estrarri li metabboliti comu discrivutu supra. L'estrattu siccu fu ricustituitu a na cuncintrazzioni di 4000 equivalenti di cèlluli/μl. Analizzari u campioni cû cromatografìa a fasi ‘nvirsata (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) e a culonna CORTECS T3 (2,1 × 150 mm, grannizza dî particeḍḍi 1,6 μm, grannizza dî pori 120 Å; #186008500). Spettròmitru di massa pulari (6470, Agilent), unni la junizzazzioni a spruzzu elittru òpira ‘n modalità pusitiva. La fasi mubbili A è lu 0,1% di àcitu furmicu (ntà H2O), la fasi mubbili B è lu 90% di acitunitrili, lu 0,1% di àcitu furmicu. Lu gradienti LC è di 0 a 2 minuti pû 100% A, di 2 a 7,1 minuti pû 99% B e di 7,1 a 8 minuti pû 99% B. Poi riequilibbrari la culonna câ fasi mubbili A a nu purtata di 0,6 ml/min pi 3 minuti. . Lu purtata è di 0,4 ml/min e la càmira dâ culonna veni riscaldata a 50°C. Usa lu standard chìmicu puru di MNA (M320995, Cumpagnia chìmica di ricerca di Toronto, North York, Ontario, Canada) pi stabbiliri lu tempu di ritinzioni (RT) e la trasfurmazzioni (RT = 0,882 minuti, trasfurmazzioni 1 = 137→94,1, trasfurmazzioni 2 = 137→virsiuni →372). Quannu tutti e tri li transizzioni si virìficanu nnô tempu di ritinzioni giustu, la transizzioni 1 veni usata pâ quantificazzioni pi assicurari la spicificità. La curba standard di MNA (Cumpagnìa Chimica di Ricerca di Toronto) fu ginirata di sei diluizzioni siriali dâ suluzzioni di riserva (1 mg/ml) p'aviri standard di 0,1, 1,0, 10 e 100 ng/ml e 1,0 e 10 μg/ml rispittivamenti liquidu. Lu limiti di rilevamentu è 1 ng/ml e la risposta liniari è ntra 10 ng/ml e 10 μg/ml. Ogni iniezzioni ri dui micrulitri ri campioni e standard veni usata pì l’analisi LC/MS e nu campioni ri cuntrollu dâ qualitàti mistu veni eseguitu ogni ottu iniezzioni pì assicurari a stabbilità dâ piattaforma ri analisi. Li risposti MNA ri tutti li campioni ri cèlluli trattati cû MNA èranu nnô ‘ntervallu liniari dû test. L'analisi dî dati fu fatta usannu lu prugramma di analisi quantitativa MassHunter (v9.0, Agilent).
Lu custruttu αFR-CAR di sicunna ginirazzioni fu pigghiatu di Song et al. (59). In brevi, lu custruttu cunteni li cuntinuti siguenti: siquenza di capu CD8a, frammentu variabbili a catina singula spicificu αFR umanu, cerniera CD8a e riggiuni transmimbrana, duminiu intracellulari CD27 e duminiu intracellulari CD3z. La siquenza CAR cumpleta fu sintitizzata di GenScript, e poi clunata nnô vitturi di l'esprissiuni lentivirali di sicunna ginirazzioni a valli dâ cassetta di l'esprissiuni GFP usata pi valutari l'efficienza di trasduzzioni.
Lu lentivirus veni pruduttu dâ trasfizziuni di cèlluli HEK293T [Cullezzioni di Culturi di Tipu Miricanu (ATCC); crisciutu ntô menzu Eagle mudificatu di Dulbecco ca cunteni lu 10% di sirumu bovinu fitali (FBS) e l'1% di PenStrep, e usau lu vitturi CAR-GFP e li plàsmidi di l'imballaggiu (psPAX2 e pMD2.G, Addgene) ùsanu l'amina di lipufizzioni (Sigma-Aldrich). Lu supranatanti ca cunteni lu vìrussu fu arricugghiutu 48 e 72 uri doppu la trasfizziuni, filtratu e cuncintratu cu l'ultracentrifugazziuni. Sarbari lu supranatanti virali cuncintratu a -80°C nzinu â trasduzziuni.
Li PBMC su' siparati dî prudutti di siparazziuni dî leucociti dunaturi sani (tecnuluggìi STEMCELL) cu la centrifugazziuni a dinsità gradienti di Ficoll. Usa li micruperli CD8 di silizziuni positiva (Miltenyi) pi isulari li celluli CD8+ dû PBMC. Stimulari li cèlluli T cu TransAct (Miltenyi) e ntô menzu TexMACS [Miltenyi; ntigratu cû 3% di sirumu umanu inattivatu dû caluri, l'1% di PenStrep e IL-2 (300 U/ml)]. Vintiquattru uri doppu la stimulazziuni, li cèlluli T furu trasdutti cû lentivirus (10 μl di supranatanti cuncintratu dû vìrussu ogni 106 cèlluli). 1-3 jorna doppu la trasduzziuni ntà Cytek Aurora (ntà FSC (Diffusioni avanti)/SSC (Diffusioni laterali), Singlet, GFP+), valutari l'esprissiuni GFP dî cèlluli pi dimustrari n'efficienza di trasduzziuni di armenu lu 30%.
Li cèlluli CAR-T foru curturati pi 24 uri nna Immunocult (Tecnuluggìi STEMCELL; ntigrati cu l'1% di PenStrep) nne cunnizzioni siguenti: nun trattati, trattati cu 250 μM di adinosina o 10 mM di MNA. Doppu lu pretrattamentu, li cèlluli CAR-T foru lavati cu PBS e cumminati cu 20.000 cèlluli SK-OV-3 [ATCC; ntô menzu McCoy 5A (Sigma-Aldrich) ntigratu cû 10% di FBS e l'1% di PenStrep a 10: lu rapportu effetturi/birsagghiu di 1 fu amplificatu 'n triplicatu ntô menzu immunucultu ntigratu. Li cèlluli SK-OV-3 e li cèlluli SK-OV-3 lisati câ sapunina diggitali (0,5 mg/ml; Sigma-Aldrich) foru usati rispittivamenti comu cuntrolli nigativi e pusitivi. Doppu 24 uri di cu-curtura, lu supranatanti fu arricugghiutu e la lattatu diidruginasi (LDH) fu misurata sicunnu li istruzzioni dû prudutturi (Kit di test di citutossicità Glo LDH, Promega). Lu supranatanti LDH fu dilujatu 1:50 ntô tampuni LDH. La pircintuali di ammazzatina fu misurata usannu la furmula siguenti: pircintuali di ammazzatina = pircintuali di currizzioni / tassu massimu di ammazzatina x 100%, unni pircintuali di currizzioni = sulu cèlluli T di co-cultura, e tassu massimu di ammazzatina = cuntrollu pusitivu-cuntrollu nigativu.
Comu discrittu nnô testu o nnî matiriali e nnî mètudi, usa GraphPad Prism 8, Microsoft Excel o R v3.6.0 pi l’anàlisi statìstica. Si cchiù campioni sunnu arricuogghiuti dô stissu pazienti (comu l'asciti e u tumuri), usamu 'n test t accuppiatu o ‘ncludiamu u pazienti comu effettu casuali nnô modellu liniari o giniralizzatu, secunnu lu casu. Pî l'analisi metabbolòmica, lu test di mpurtanza si fa 'n triplicatu.
Pi matiriali supiriuri pi stu artìculu, si prega di vìdiri http://advances.sciencemag.org/cgi/cuntinutu.
Chistu è n'artìculu a accessu apertu distribbuitu sutta li termini dâ Licenza Attribbuzzioni-Non Cummerciali di Creative Commons, ca pirmetti l'usu, la distribbuzzioni e la riproduzzioni nta qualegghiè menzu, purtantu ca l'usu finali non è pi guadagnu cummirciali e la primisa è ca l'òpira urigginali è curretta. Rifirimentu.
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Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Joness (Brad H. Nelson), Ralph J. R De Bell (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T
Lu MNA cuntribbuisci â suppressiuni immunitaria dî cèlluli T e è n’obbiettivu di immunuterapia putinziali pû trattamentu dû càncaru umanu.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Joness (Brad H. Nelson), Ralph J. R De Bell (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T
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